Inyección de lipopolisacárido en ratones para imitar la entrada de productos derivados de microbios después de la ruptura de la barrera Intestinal
Summary
Aquí se presenta un protocolo para imitar la entrada de compuestos derivados de bacterias después de la ruptura de la barrera intestinal. Una baja dosis subletal de lipopolisacárido se inyectó sistémica en ratones, que fueron supervisados para la inyección después de 24 h. La expresión de citoquinas proinflamatorias se determinó en varios puntos del tiempo en bazo, hígado y colon.
Abstract
La barrera epitelial intestinal separa el host de la microbiota que normalmente es tolerada o ignorada. Resultados de la violación de esta barrera en la entrada de bacterias o productos derivados de las bacterias en el host, acceso a la circulación de host y órganos internos, llevando a la inflamación incontrolada, como se observa en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que se caracterizan por un aumento de la permeabilidad epitelial intestinal.
Para imitar la entrada de compuestos derivados de bacterias en el host, un modelo de endotoxemia ha sido adoptado en que lipopolysaccharide (LPS), un componente de la pared celular externa de bacterias Gram-negativas, fueron inyectadas en ratones. En este estudio, una dosis subletal de LPS se inyectó por vía intraperitoneal y los ratones fueron posteriormente monitoreados durante 8 h con un marcador de enfermedad. Además, la expresión se analizaron los niveles de las citoquinas pro-inflamatorias Il6, Il1b y Tnfa en bazo, hígado y colon por qPCR en diferentes puntos temporales post inyección de LPS. Este modelo puede ser útil para los estudios de investigación de la respuesta inmune después de la invasión de microorganismos o productos derivados de la bacteriana causados por una violación de la barrera de las superficies del cuerpo.
Introduction
El intestino humano es colonizado con un gran consorcio de microorganismos que forman la microbiota, que ha desarrollado una relación mutuamente beneficiosa con el anfitrión durante la evolución. En esta relación, el anfitrión ofrece un lugar seguro para la microbiota, mientras que la microbiota proporciona vitaminas, nutrientes digestión y protección contra agentes patógenos al host, donde la microbiota reside1. Cuando se altera esta relación beneficiosa entre el host y la microbiota, pueden desarrollar enfermedades, tales como enfermedad inflamatoria intestinal (EII). EII es una enfermedad inflamatoria crónica multifactorial del intestino causada por factores genéticos y ambientales que se presentan en dos formas principales, (CD) de la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (Cu). A pesar de las similitudes entre las dos formas de EII, se caracterizan por ciertas diferencias en la ubicación y naturaleza de las modificaciones inflamatorias. CD es un desorden inflamatorio de recaída transmural que potencialmente se puede extender a cualquier parte del tracto gastrointestinal, mientras que la UC es no transmural y se limita a los dos puntos. Además, las mutaciones de nucleótido-Oligomerización dominio-que contienen proteína 2 (NOD2), un receptor de reconocimiento de patrón (PRR) que reconoce Muramil dipéptido (MDP), un componente de la pared celular de más bacterias Gram positivas y – negativo, es asociados con el CD2. Además, Listeria y estreptococos , Escherichia coli (e. coli)y sus productos todos se encontraron dentro de los macrófagos en pacientes con EC que han entrado en el host después de que una barrera de incumplimiento3. Cuando las bacterias o sus productos entran en el host durante el desarrollo del CD, el sistema inmunológico desarrolla una respuesta lleva a la producción de anticuerpos anti-bacterial4en circulación. Tal vez, la evidencia más convincente para el papel de la microbiota en la patogenia de la EII deriva en modelos de ratón. Cuando los animales son tratados con antibióticos, o cuando los ratones se mantienen en condiciones libres de gérmenes de (GF), la severidad de la enfermedad se reduce en la mayoría de los modelos de colitis, como de IL-10-/-ratones que desarrollan colitis en GF instalaciones5,6. Además, la colitis también perturba la composición de la microbiota, que se caracteriza por una composición desequilibrada y reducida riqueza llamada disbiosis7. La consecuencia de la EII puede ser un aumento de la permeabilidad intestinal que puede conducir a la entrada de microbios y productos derivados de microbios en el host.
En los animales, la aplicación de sulfato de sodio-dextrano (DSS) induce una infracción epitelial intestinal conduce a un aumento de la permeabilidad de la barrera epitelial8. Portal LPS concentraciones son elevadas en animales con DSS colitis9. Curiosamente, animales que carecen el C tipo lectina receptor adherencia intracelular específica molécula-3 ase nonintegrin relacionadas con homólogo 1 (señal-R1) son protegidos de colitis DSS y endotoxemia inducida por LPS10. Para difundir aún más en el huésped, bacterias o productos derivados de las bacterias tienen que pasar la barrera vascular11, la cavidad peritoneal, donde se encuentra el intestino pequeño y grande, los nodos de linfa mesentéricos y el hígado12. Para reducir la complejidad de este sistema, se utilizó un compuesto de origen bacteriano definido. LPS, que causa la endotoxemia después intraperitoneal (i.p.) o intravenosa (i.v.) inyección13 se inyectó en ratones, para estudiar la expresión de interleuquinas Il6 y Ilb y la citoquina Tnfa en respuesta a LPS.
LPS es un patrón asociado a patógenos molecular (PAMP) expresado como un componente de la pared celular de bacterias Gram-negativas, que consiste en lípido A (PAMP principal en la estructura del LPS), un oligosacárido núcleo y una O lado cadena14. Receptor de tipo Toll 4 (TLR4) expresadas por las células dendríticas, macrófagos y células epiteliales reconoce LPS15, que requiere de receptores de cooperación para el enlace apropiado. La fase aguda proteína de unión a LPS (LBP) une a LPS para formar un complejo que transfiere LPS al cluster de diferenciación 14 (CD14), una proteína de membrana glicosilfosfatidilinositol anclada. CD14 más lanzaderas LPS para antígeno de linfocito 96 o también conocido como el MD-2, que se asocia con el dominio extracelular de TLR4. La Unión del LPS a MD-2 facilita la dimerización del TLR4/MD-2 inducen cambios conformacionales para reclutar moléculas intracelulares adaptador para activar el downstream señalización vía14, que incluye la diferenciación mieloide primaria gen de respuesta 88 (MyD88) – camino del dependiente y el TIR dominio-que contienen adaptador induce interferón-β (TRIF) – dependiente de la vía16. El reconocimiento de los LPS por TLR4 activa la vía de NF-κB e induce la expresión de citocinas proinflamatorias, como el TNFα, IL-6 e IL-1β17.
En particular, cuando LPS se inyecta en animales, la concentración de LPS a los animales, el fondo genético del animal y la dieta tiene que ser considerado. Altas concentraciones de LPS conduce a un choque séptico, caracterizado por hipotensión y fallos múltiples del órgano y finalmente a muerte18. Ratones son menos sensibles al LPS comparados con los seres humanos, donde están capaces de inducir una tormenta del cytokine del19LPS las concentraciones entre 2-4 ng/kg de peso corporal (BW). Para los ratones, la dosis letal (DL50), que induce la muerte en la mitad de los rangos de ratones de 10-25 mg/kg BW20 dependiendo de la cepa de ratón utilizada. Para las cepas utilizadas ratón C57Bl/6 y BALB/c, la dosis letal 50% (DL50) es de 10 mg/kg BW. En contraste, las cepas C3H/HeJ y C57BL/10ScCr son protegidas de endotoxemia inducida por LPS, que es debido a mutaciones en Tlr421. En consecuencia, deficientes en Tlr4 ratones son hyporesponsive a las inyecciones con LPS22. Otras líneas de ratón modificados genéticamente, como PARP1/ratones23 son resistentes al choque tóxico inducida por LPS.
El modelo de ratón descrito aquí utiliza una dosis subletal de LPS administrado sistémicamente para imitar las consecuencias de la difusión de LPS después de una ruptura de la barrera de las superficies del cuerpo. La concentración de LPS solicitada (2 mg/kg BW) no indujo mortalidad en ratones C56Bl/6, pero la inducida por liberación de citoquinas proinflamatorias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo imita procesos inmunológicos que se producen después de la invasión de productos derivados de microbios. Pasos críticos en el protocolo son la selección de la línea de ratón, el estado de higiene de los ratones, la dosis de LPS, el seguimiento de los animales para la aparición de endotoxemia y el momento de la terminación del experimento. Lo más importante, el fondo genético de la cepa de ratón ha de ser considerada. Cepas de ratón diferentes tienen diferente susceptibilidad a LPS. Por ejemplo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN es apoyado por la Fundación Nacional Suizo (FNS 310030_146290).
Materials
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).
- Liu, Y., et al. Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn’s disease. Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).
- Schaffer, T., et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn’s patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans. Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).
- Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).
- Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 4, 28 (2014).
- Schaubeck, M., et al. Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn’s disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence. Gut. 65, 225-237 (2016).
- Steinert, A., et al. The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models. J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).
- Gabele, E., et al. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH. J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).
- Saunders, S. P., et al. C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide. J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).
- Spadoni, I., et al. A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science. 350, 830-834 (2015).
- Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).
- Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins. Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Deng, M., et al. Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).
- Kagan, J. C., et al. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Cohen, J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 420, 885-891 (2002).
- Suffredini, A. F., et al. Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration. J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5, 143-153 (2014).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282, 2085-2088 (1998).
- Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).
- Corral, J., et al. Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models. Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).
- Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7, 233 (2014).
- Brandwein, S. L., et al. Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora. J Immunol. 159, 44-52 (1997).
- Macpherson, A. J., McCoy, K. D. Standardised animal models of host microbial mutualism. Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology. J Immunol. 199, 383-388 (2017).
- Wirtz, S., et al. Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27. J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).
