미세한 생물의 게놈 시퀀싱 하는 동안 오염에는 큰 문제가 남아 있다. 여기, 우리가 오염 위험을 최소화 하기 위해 전체 게놈 증폭 없이 genomic DNA의 작은 50 세와 단일 표본에서 tardigrade의 게놈을 시퀀싱 하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
Tardigrades는 ametabolic 상태가 물 제공 이라고 anhydrobiosis 건조 및 수를 직면 하는 때 그들의 원래 상태로 돌아가기 현미경 동물 이다. Tardigrades 위험 세균 오염 때로는 같은 미세한 동물의 게놈 시퀀싱이이 동물에서 수평 한 유전자 이동의 범위에 관한 예를 들어 잘못 된 해석에 지도 한다. 여기, 우리는 하나의 견본에서 tardigrade, Hypsibius dujardini의 게놈을 시퀀싱 하는 ultralow 입력된 방법을 제공 합니다. 50의 효율적인 추출 함께 엄격한 세척 및 오염 물질 제외를 채용 하 여 ~ 한 개인에서 200 pg genomic DNA, 우리 건설 DNA 시퀀싱 장비 시퀀싱 라이브러리. 이러한 라이브러리 높은 재현성 및 편견, 그리고 다른 H. dujardini 유전자와 시퀀스 읽기의 정보학 분석 오염의 최소한의 금액을 보여주었다. 이 메서드는 이전 방법을 사용 하 여 시퀀싱 할 하지 unculturable tardigrades을 적용할 수 있습니다.
서론
Tardigrades는 건조를 직면 하는 때 anhydrobiosis를 호출 하는 ametabolic 상태를 입력할 수 있는 미세한 동물 이다. 그들은 물1,2의 흡수에 의해 복구. Tardigrades는 ametabolic 상태에서 다양 한 극한 환경 극한의 온도 압력3 4,5, 자외선 빛6, x-레이, 그리고 감마선의 높은 복용량을 포함 하는 견 뎌 할 수 있다 7 , 8, 그리고 우주 공간9. 게놈 데이터는 anhydrobiosis의 분자 메커니즘의 연구에 대 한 필수적인 기초.
Tardigrades의 게놈을 시퀀싱 하는 이전 시도 세균 오염10,11,
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프로토콜
1입니다. 준비
- 2 %agarose 젤 90 m m 플라스틱 문화 접시, 그리고 1% 페니실린/스 DW와 칵테일의 10 mL에 용 매로 증류수 (DW)를 사용 하 여 준비 합니다. 젤 18 ° c.에 설정 하는 인큐베이터에 2-3 주 동안 저장 될 수 있다
참고: 낮은 온도 agarose 젤, 젤과는 tardigrades 갇혀 있을 수 있는 문화 접시 벽 사이의 소문자 간격의 결과로 축소에 대 한 10 ° c, 젤의 어떤 저장을 하지 마십시오.
2. 샘플 준비 및 오염 물질 배제
- 단일 tardigrade 수집 하 고, 준비 한 접시에 그것을 배치 하 고 그것을 씻어 x-모든 나머지 입자를 제거 하는 DW와 함께 3 x 2.
- 창 자에서 어떤 과잉 음식 든 지 제거를 24 h에 대 한 18-22 ° C에서 tardigrade 품 어.
- 2-6 h P10 피 펫을 사용 하 여 깨끗 한 슬라이드 유리에 소독된 동물을 어떤 세균 오염 제거에 대 한 페니실린/스 항생제에 굶주린된 tardigrade를 놓습니다.
- 500 X 확대 현미경 tardigrade 관찰 하 고 나머지 박테리아 없음 확인.
참고:는 stereomicroscope와 높은 확대 ....
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결과
오염 물질 배제:
이 프로토콜은 tardigrade와 오염을 최소화 하기 위해 항생제 치료와 살 균의 철저 한 씻기를 포함 한다. 그것은 또한 이러한 프로세스의 완전성을 보장 하기 위해 시각적 검사 과정을 포함 한다. 유효성 검사 (2.4/프로토콜 단계) 동안 현미경 이미지를 그림 2에 표시 됩니다. 500 X 배율에서 관찰 하는 경우 개별 tardigrade 주위에 이동 하는 작은 입자로 세균 세포를 볼 수 있습니다.
DNA 라이브러리 품질의 유효성 검사:
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토론
세균성 오염 미세한 생물의 게놈 시퀀싱에 위협이 포즈. Tardigrade 게놈 시퀀싱에 대 한 이전 연구는 오염 광범위 한 정보학 방법을12,20를 사용 하 여 필터링 하는 동안 우리는 오염 위험을 최소화 하기 위해 하나의 개별에서 게놈 시퀀싱. 개별 tardigrade genomic DNA16 의 약 50-200 pg 포함 되어 있기 때문에 키 틴 질 외 골격의 두꺼운 층에 쌌 다, 오염 물질 및 양질의 DNA 추출의 배제는이 프로토콜에 중요 한 포인트. 기존 tardigrades 문화는 무 균, 그리고 그 수집 된 야생 수행에서 오염 물질의 많은 그들의 창 자에 식품의 표면에. Tardigrades의 이전 게놈 시퀀싱 프로젝트 총칭 한 샘플12,14, 결과 세균 오염에 의해.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 노조미 아베, 타 카 유키, 그리고 Nahoko이 시이 게놈 시퀀싱에 그들의 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 선진적인 일본 사회에 대 한 과학 진흥 (JSP) 연구원, 젊은 과학자 (No.22681029), KAKENHI 특정 한 KAKENHI 특정에 대 한 과학적 연구 (B), 제 17 H 03620는 JSP에서 여는 스미 토모 재단 (No.140340)에서 그리고 야마가타 현 쓰루 오카 시, 일본에서 연구 기금에 의해 부분적으로 기본적인 과학 연구 프로젝트에 대 한 그랜트. tardigrades를 피드 하는 데 사용 되는 클로렐라 vulgaris 클로렐라 산업 주식회사의 제공 했다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| SZ61 현미경 | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| 페니실린 스트렙토마이신(10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL 실리콘 코팅 튜브 | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA 마이크로프렙 키트 | ZYMO Research | D3021 | 이 키트의 사용은 절대적으로 중요합니다. 3.1 단계 참조 |
| 1.5 mL 마이크로튜브 | greiner bio-one | 616-201 | 4.1.1 |
| HIgh speed rerigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | ||
| ThruPLEX DNA-Seq 키트 | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | 이 키트의 사용은 절대적으로 중요합니다. 단계 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP 시약 | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 참조 | |
| 2200 TapeStation | 애질런트 | G2965AA | |
| D1000 시약 | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq 시퀀서 | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
참고문헌
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P.
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재인쇄 및 허가
