Indagando Teliospore germinazione utilizzando analisi Microrespiration e Microdissection
Summary
Smut funghi causano molte malattie devastanti agricoli. Sono dispersi come teliospores dormienti che germinano in risposta a stimoli ambientali. Descriviamo due metodi per studiare i cambiamenti molecolari durante la germinazione: aumento di respirazione per rilevare l’attivazione metabolica di misurazione e valutazione cambiando eventi molecolari isolando teliospores alle fasi morfologiche distinte.
Abstract
Smut funghi sono gli agenti eziologici di parecchie malattie devastanti agricoli. Sono caratterizzati dalla produzione di teliospores, che sono agenti di dispersione dalle pareti spesse. Teliospores possono rimanere latenti per decenni. La dormienza è caratterizzata da tassi metabolici bassi, in pausa biosintesi macromolecolari e notevolmente ha ridotto i livelli di respirazione. Alla ricezione di segnali ambientali richiesti, teliospores germinare per produrre cellule aploidi, che possono avviare nuovi cicli di infezione. Germinazione di teliospore è caratterizzata dalla ripresa delle biosintesi macromolecolari, respiratorio aumentato e drammatici cambiamenti morfologici. Al fine di misurare con precisione i cambiamenti nella respirazione cellulare durante le prime fasi di germinazione, abbiamo sviluppato un semplice protocollo che impiegano un respirometro Clark-tipo. Le successive fasi di germinazione si distinguono per specifici cambiamenti morfologici, ma la germinazione è asincrona. Abbiamo sviluppato una tecnica di microdissezione che permetta di raccogliere teliospores in fasi distinte di germinazione.
Introduction
I funghi di fuliggine (Ustilaginales) consistono di oltre 1.600 specie che infettano erbe tra cui l’importante cereali di mais, orzo e grano, causando miliardi di dollari in perdite di raccolto ogni anno1. Questi funghi sono caratterizzati dalla produzione di teliospores, che hanno la pelle scura delle pareti cellulari e sono gli agenti di dispersione. Teliospores funzione per proteggere il materiale genetico durante le sollecitazioni di dispersione tra piante ospiti e può persistere in uno stato dormiente per anni2. Come tale, teliospores sono una componente essenziale della diffusione della malattia.
Al fine di studiare biologia teliospore, il nostro laboratorio utilizza il fungo di oscenità modello Ustilago maydis (U. maydis), che è l’agente causale della malattia ‘comune oscenità di mais’. Maturo U. maydis teliospores sono caratterizzati da arresto della crescita, il metabolismo cellulare ridotto e bassi livelli di respirazione cellulare3. In condizioni ambientali favorevoli (ad es., la presenza di specifici zuccheri), U. maydis teliospores germinano e completare le basidiospore di meiosi, producendo che possono avviare nuovi cicli di infezione. Germinazione è caratterizzata da respiratorio aumentato, il ritorno ad metabolico attività e la progressione attraverso stadi morfologici osservabile di germinazione4.
La fase iniziale di germinazione include respiratorio aumentato e funzione metabolica, tuttavia, non esistono indicazioni morfologiche del cambiamento. Le misure originali del cambiamento respiratorio in U. maydis sono state effettuate da oltre 50 anni fa, misurare il consumo di ossigeno manometrico con un apparato di boccetta Warburg5. Abbiamo sviluppato un metodo nuovo e semplice di studio precisi cambiamenti nella respirazione durante la germinazione teliospore misurando il consumo di ossigeno sopra un corso di tempo di germinazione utilizzando un microrespirometer Clark-tipo. Abbiamo precedentemente utilizzato questo metodo per studiare i cambiamenti nella frequenza respiratoria tra selvaggio-tipo cellule aploidi U. maydis e mutanti con i mitocondri difettosi6ed hanno adattato il protocollo qui per studiare i cambiamenti nella respirazione teliospore durante germinazione. Questo consente di identificare con precisione i tempi del cambiamento di respirazione in modo che noi possiamo target teliospores al momento opportuno dopo l’inizio della germinazione di indagare gli eventi molecolari iniziali. La progressione di germinazione può essere seguita microscopicamente una volta emerge il promycelia dalla teliospore, ma la natura asincrona ha inibito l’isolamento di abbastanza teliospores in una fase determinata per le indagini. Abbiamo sviluppato una tecnica di microdissezione simile a quelli utilizzati per la fecondazione in vitro per raccogliere fisicamente teliospores presso morfologiche distinte fasi di germinazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fitopatogeni basidiomicete biotrophic causano ogni anno miliardi di dollari in perdite di raccolto. La stragrande maggioranza di questi patogeni produce teliospores che sono parte integrante della dispersione fungine e riproduzione sessuale. Acquisire conoscenze dello sviluppo e germinazione di teliospores è fondamentale per comprendere la diffusione delle malattie devastanti causati da questi funghi. Al fine di identificare alterazioni molecolari nei punti chiave di controllo abbiamo messo a punto un metodo per identif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Paul Frost per uso di sua microrespirometer e Nicole Wagner e Alex Bell per assistenza tecnica. Quest’opera è stata finanziata da una sovvenzione NSERC a B.J.S.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
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