Microrespiration 分析と顕微解剖を使用して冬の発芽を調査
Summary
クロボ菌類は、壊滅的な農業の多くの病気を引き起こします。彼らは環境のキューに応答で発芽休眠の寄主として分散しています。発芽過程における分子の変化を調査する 2 つの方法の概要を説明: 呼吸増加代謝活性化を検出するための測定と形態学的段階に寄主を分離することによって変化する分子イベントを評価します。
Abstract
クロボ菌類は、いくつかの壊滅的な農業病気の病因のエージェントです。彼らは肉厚分散エージェントである寄主の生産によって特徴付けられます。寄主は、何十年も休眠することができます。休眠は、低代謝率によって特徴付けられる、高分子生合成を一時停止し、呼吸のレベルを大幅に削減します。必要な環境シグナルを受け取ったら、寄主は感染症の新ラウンドを開始することができます半数体の細胞を生産する発芽します。冬の発芽は、高分子合成、高められた呼吸および劇的な形態学的変化の再開によって特徴付けられます。発芽の初期段階中に細胞呼吸の変化を正確に測定、するためにクラーク型呼吸度計を用いた単純なプロトコルを開発しました。発芽の後の段階は特定の形態学的変化によって区別されますが、発芽は非同期です。我々 は異なる発芽段階で寄主を収集するために私たちができる顕微解剖技術を開発しました。
Introduction
黒穂病菌 (Ustilaginales) から成っている牧草、トウモロコシ、大麦、小麦の重要な穀物を含む作物の損失のドルの十億を引き起こす感染以上 1,600 種年間1。これらの菌は、寄主細胞壁を発色が暗く、散布剤の生産によって特徴付けられます。寄主はホスト植物の間分散のストレスの中に遺伝物質を保護するために機能し、2年間休止状態で保持できます。そのため、寄主は病気の広がりの重要なコンポーネントです。
冬の生物学を研究するためには、当研究室は、モデル黒穂病菌経路(米国アルテリシジン) ‘トウモロコシの共通黒穂病’ 病気の原因物質であるを利用しています。成熟した米国アルテリシジン寄主は増殖停止、減らされた細胞の代謝と細胞呼吸3の低レベルによって特徴付けられます。有利な環境条件 (e.g。、特定の糖の存在)、米国アルテリシジン寄主が発芽し、減数分裂、生産担子胞子による感染症の新ラウンドを開始することができますこれを完了。発芽は、高められた呼吸、代謝に戻り活動、発芽4の観察可能な形態学的段階を経て進行が特徴です。
発芽の初期段階に高められた呼吸と代謝機能が含まれています、ただし、変更の形態学的兆候がないです。米国アルテリシジンの呼吸の変化の元の測定は Warburg フラスコ装置5マノメーターで高い酸素消費を測定 50 年以上前に行われました。クラーク型 microrespirometer を使用して発芽の時間経過とともに酸素消費量を測定することによって冬発芽時における呼吸の正確な変化を研究する新しい、シンプルな方法を行った。野生型の呼吸速度の変化を研究するこのメソッドが以前米菌細胞の倍加と不良ミトコンドリア6、変異体中に冬の呼吸速度の変化を勉強するここのプロトコルを適応していると発芽。これは早い分子でき事を調査するため発芽開始後の適切な時期に寄主を対象することができますようにする呼吸の変更のタイミングを正確に識別できる手段を提供します。一度、冬から、promycelia が出てくるが、非同期の性質は調査の特定の段階で十分な寄主の分離を抑制、発芽の進行は顕微鏡的続くことができます。我々 は、物理的に発芽の形態学的段階で寄主を収集する体外受精に使用するものと同様レーザーマイクロダイ セクション技術を開発しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
担子菌赤植物病原菌は、毎年作物の損失の数十億ドルを引き起こします。これらの病原体の大半は、真菌の散布と有性生殖に不可欠な寄主を生成します。寄主の発芽と開発の知識を得ることは、これらの菌によって引き起こされる破壊的な病気の広がりを理解する重要です。主な制御点で分子の変更を識別するために我々 は、生理学的変化と発芽の段階で寄主を分離する別のタイミングを識…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼の microrespirometer の使用のための博士ポール霜とニコール ワーグナーとアレックス ベルのテクニカル サポートに感謝したいと思います。この作品資金が供給された B.J.S. するレベルの補助金
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E., Swan, A. . Meiosis – Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. , 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. . Monograph Number 2. , (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. . Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , (2013).
- Fröhlich, J., König, H., König, H., Varma, A. . Soil Biology – Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. , 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
