Undersöka Teliospore grobarhet med Microrespiration analys och lokalt
Summary
Smut svampar orsakar många förödande jordbruks sjukdomar. De sprids som vilande teliospores som gror i svar på miljömässiga ledtrådar. Vi beskriver två metoder för att undersöka molekylära förändringar under groning: mäta andning ökar för att upptäcka metabolisk aktivering och bedöma ändra molekylära händelser genom att isolera teliospores distinkta morfologiska skeden.
Abstract
Smut svampar är etiologiska agenter för flera förödande jordbruks sjukdomar. De kännetecknas av produktionen av teliospores, som är tjocka spridning agenter. Teliospores kan förbli vilande i årtionden. Dvala kännetecknas av låg ämnesomsättning priser, pausade makromolekylära biosyntes och kraftigt sänkta nivåer av andning. Efter mottagandet krävs Miljösignaler, GRO teliospores för att producera haploida celler, som kan initiera nya omgångar av infektion. Teliospore grobarhet kännetecknas av återupptagandet av makromolekylära biosyntes, ökad andning och dramatiska morfologiska förändringar. För att exakt mäta förändringar i cellandningen under de tidiga stadierna av grobarhet, har vi utvecklat ett enkelt protokoll som sysselsätter en Clark-typ respirometer. De senare stadierna av grobarhet kännetecknas av specifika morfologiska förändringar, men grobarhet är asynkron. Vi utvecklade en lokalt-teknik som gör det möjligt för oss att samla in teliospores distinkta grobarhet skeden.
Introduction
De smut svamparna (Ustilaginales) består av över 1600 arter som infekterar gräs inklusive de viktiga spannmål av havre, korn och vete, orsakar miljarder dollar i skördeförluster årligen1. Dessa svampar kännetecknas av produktionen av teliospores, som har mörkt pigmenterade cellväggar och är spridning agenter. Teliospores funktion för att skydda genetiska materialet under stressiga spridning mellan värdväxter och kan kvarstå i ett vilande tillstånd för år2. Som sådan, är teliospores en viktig komponent i sjukdomen sprids.
Vårt laboratorium använder för att studera teliospore biologi, och tredjeparts modell smut svampen Ustilago maydis (U. maydis), vilket är den kausala smittämnet ‘gemensamma smut majs’. Mogen U. maydis teliospores kännetecknas av tillväxt gripandet, minskad cellulär metabolism och låga nivåer av cellandningen3. Under gynnsamma miljöförhållanden (t.ex., förekomsten av specifika sockerarter), U. maydis teliospores gror och slutföra meios, producerande källor som kan initiera nya omgångar av infektion. Grobarhet kännetecknas av ökad andning, återgång till metaboliska aktiviteten och progression genom observerbara morfologiska stadier av grobarheten4.
Inledningsskedet av grobarhet inkluderar ökad respiration och metabolisk funktion, men det finns inga morfologiska tecken på förändring. De ursprungliga mätningarna av respiratoriska förändringar i U. maydis genomfördes över 50 år sedan, mäta syreförbrukning manometrically med en Warburg kolv apparater5. Vi har utvecklat en ny, enkel metod att studera exakt förändringar i andningen under teliospore grobarhet genom att mäta syreförbrukning under en tid av grobarheten använder en Clark-typ microrespirometer. Vi tidigare använde denna metod för att studera förändringar i andningsfrekvens mellan vildtyps- U. maydis haploida celler och mutanter med defekta mitokondrierna6, och har anpassat protokollet här för att studera förändringar i teliospore andning under grobarhet. Detta ger ett sätt att korrekt identifiera tidpunkten för respiration förändring så att vi kan rikta teliospores vid lämplig tidpunkt efter inledningen av grobarhet att undersöka tidiga molekylära händelser. Progressionen av grobarhet kan följas mikroskopiskt när promycelia framträder ur teliospore, men den asynkrona naturen hämmas tillräckligt teliospores isolering på ett visst Stadium för utredning. Vi utvecklat ett lokalt teknik liknande dem som används för in vitro- befruktning fysiskt samla teliospores på olika morfologiska faser av grobarhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Giftig biotrophic växt patogener orsaka miljarder dollar i skördeförluster årligen. Majoriteten av dessa patogener producera teliospores som är sammanbyggda till svamp spridning och sexuell reproduktion. Att få kunskap om utvecklingen och groning av teliospores är avgörande för att förstå spridningen av de förödande sjukdomar som orsakas av dessa svampar. För att identifiera molekylära förändringar på viktiga kontrollpunkter har vi utarbetat en metod för att identifiera tidpunkten för fysiologiska fö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Paul Frost för användning av hans microrespirometer, och Nicole Wagner och Alex Bell för tekniskt bistånd. Detta arbete finansierades genom en NSERC bidrag till B.J.S.
Materials
| Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
| Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
| Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
| 1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
| Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
| Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Unisense MicroRespiration system | |||
| MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
| MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
| MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
| SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
| MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
| MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
| Microdissection system | |||
| Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
| Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
| Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |
References
- Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E., Swan, A. . Meiosis – Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. , 411-460 (2012).
- Christensen, J. J. . Monograph Number 2. , (1963).
- Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).
- Allen, P. J. Metabolic aspects of spore germination in fungi. Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).
- Warburg, O. Metabolism of tumours. Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).
- Ostrowski, L. A., Saville, B. J. Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).
- Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).
- Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis. Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).
- Stade, S., Brambl, R. Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa. J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).
- Brambl, R. Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores. Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).
- Sacadura, N. T., Saville, B. J. Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores. Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).
- Hilderbrand, E. M. Techniques for the isolation of single microorganisms. Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).
- Seto, A. M. . Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , (2013).
- Fröhlich, J., König, H., König, H., Varma, A. . Soil Biology – Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. , 425-437 (2006).
- Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 11 (1999).
- Sherman, F. Getting started with yeast. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).
- Chen, Y., Seguin-Swartz, G. A rapid method for assessing the viability of fungal spores. Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).
