自立电化学建立富集阳极 respiring 菌现场
Summary
现场微生物富集或原位栽培技术可以促进分离难培养的微生物群, 尤其是低生物量或地球化学极端环境。在这里, 我们描述了一个电化学设置不使用外部的电源, 以丰富微生物菌株, 有能力的细胞外电子运输 (EET)。
Abstract
厌氧呼吸耦合电子运输到不溶性矿物 (称为胞外电子传输 [EET]) 被认为是关键的微生物能源生产和持久性在许多地下环境, 特别是那些缺乏可溶性终端电子受体。虽然 EET 的微生物已成功地从不同的环境中分离出来, 但 EET 的细菌多样性仍然不太清楚, 特别是在难以取样、低能或极端环境下, 如许多地下生态。在这里, 我们描述了一个现场电化学系统, 以丰富的 EET 能力的细菌使用阳极作为呼吸终端电子受体。这个阳极连接到能够催化非生物氧还原的阴极。将此方法与使用恒电位仪中毒电极电位的 electrocultivation 方法进行比较, 双电极系统不需要外部电源。我们提供了一个例子, 我们的现场浓缩利用在一个碱性池塘在雪松, 一个地面 serpentinization 遗址在加利福尼亚州北部。以前试图培养的矿物质还原菌是不成功的, 这可能是由于该网站的低生物量的性质和/或低相对丰度的金属还原微生物。在实现双电极富集之前, 我们测量了溶解氧浓度的垂直剖面。这使我们能够将碳毡阳极和铂电镀碳毡阴极放在深度, 以支持厌氧和有氧过程, 分别。在现场孵化之后, 我们进一步丰富了实验室中的阳极电极, 并证实了与通常在雪松上观察到的表面附着或生物膜群落相比, 有明显的微生物群落。这种浓缩后来导致了从雪松中分离出的第一 electrogenic 微生物。这种现场微生物富集的方法有可能极大地增强从低生物量或难以取样生境的 EET 细菌的分离。
Introduction
一些矿物还原微生物被证明利用固相矿物作为终端电子受体, 通过细胞外电子传输 (EET) 过程, 通过氧化还原酶1将电子传导到细胞的外部。EET 是关键, 不仅对微生物矿物过程, 但也应用能源和环境技术, 如微生物燃料电池2, 电极合成3, 和生物修复4。新的 EET 细菌是高度追求, 并已广泛研究从基本或应用的角度5。然而, 我们对这些细菌的生态或生物地球化学意义的洞察力有限。大多数 EET 的微生物是从水, 沉淀物, 或厌氧的消化器, 利用固体电子受体, 如 MnO2, Fe2O3或准备电极在实验室6,分离出来的,7,8. 然而, 这些方法往往产生类似的联营集团, 可能会错过可能主宰低能量或低生物量系统的更敏感分类群, 从而使这些微生物适应实验室或无菌文化环境的能力降低9.通常对于低生物量环境, 大量的水从一个地点被过滤, 以集中细菌细胞。然而, EET 的细菌往往表现出厌氧代谢, 因此氧气暴露可能进一步抑制或阻止他们的耕种。替代的现场方法, 以集中细胞而不暴露于氧气, 可以促进分离 EET 细菌。在这里, 我们报告的安装细节的现场电化学技术, 以丰富 EET 能力的微生物在很长一段时间内, 而不需要外部电源。
使用我们的 electrocultivation 实验从一个高碱性的春天在加利福尼亚北部, 雪松10, 我们描述这种现场电化学技术。serpentinization 在雪松中的地球化学特征受到地下的影响。弹簧高度还原, 氧气浓度低于在空气水界面下检测的限度, 突出了在这个功能性缺氧环境11通过 EET 微生物能源生产的潜力。然而, 没有证据支持 EET 的微生物从雪松 (在 16S rRNA 或宏基因组分析)。尽管这种环境被认为是电子受体有限的, 但利用不溶性矿物作为终端电子受体的潜力, 包括矿物, 如由 serpentinization 产生的铁霸矿物 (即,磁铁矿), 尚未广泛调查12。因此, 我们部署了我们的电化学系统在营地春天, 在雪松高 pH 值的春天, 以丰富的 EET 微生物 (图1)13。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本文的研究中, 我们展示了一个微生物联合体的富集, 与原位电流的生产联系在一起。目前, 该系统在短期和长期的时间尺度上支持微生物活性的观察模式。构建功能性双电极 (燃料电池型) 系统的关键步骤是识别和利用环境中具有稳定水位和氧浓度的位置。阴极在空气水界面接触氧气, 而阳极则保持在厌氧条件下, 电极电位差促进 EET 细菌的厌氧呼吸。
我们观察了环境?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢罗杰 Raiche 和大卫 McCrory 允许我们进入雪松和咨询的地点, 长期孵化。我们还感谢雪松现场船员在2013-2014 赛季: 四野铃木, 俊一, 格雷格 Wanger, 格雷森, 柏林和马修 Schechter。另外多亏了四野铃木和赫斯·贝克 Kuenen 的深入研究和培养支持。这项工作是通过向日本促进科学学会 (jsp) KAKENHI 赠款编号17H04969 和26810085的年轻科学家 a 和 B 资助的, 以及日本医学研究和发展局 (17gm6010002h0002) 提供的。美国提供的资金由美国全球海军研究办公室 (N62909-17-1-2038) 和黑暗能源生物圈调查中心 (德碧) (OCE0939564) 和美国宇航局天体生物学研究所-生活地下 (泥路) (NNA13AA92A)。这项工作的一部分是作为日本促进科学学会的一部分进行的: Kazuhito 桥本实验室的东京大学 PE15019 的短期博士后奖学金。
Materials
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
References
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