Frittstående elektrokjemiske satt opp til å berike Anode-respiring bakterier på stedet
Summary
Stedets mikrobiell berikelse eller i situ dyrking teknikker kan lette isolering av vanskelig-å-kultur mikrobiell taxa, spesielt fra lav-biomasse eller geochemically ekstreme miljøer. Her beskriver vi en elektrokjemisk oppsett uten å bruke en ekstern strømkilde for å berike mikrobiell stammer som kan ekstracellulære elektronet transport (lunsj).
Abstract
Bruke karbohydrater respirasjon kombinert med elektronet transport til uløselig mineraler (referert til som ekstracellulære elektronet transport [lunsj]) er antatt å være avgjørende for mikrobiell energiproduksjon og utholdenhet i mange undergrunnen miljøer, spesielt de mangler løselig terminal elektron acceptors. Mens lunsj-kompatible mikrober har vært vellykket isolert fra ulike miljøer, mangfoldet av bakteriene i stand til lunsj er fremdeles dårlig forstått, spesielt i vanskelige-å-prøve, lav energi eller ekstreme miljøer som mange undergrunnen økosystemer. Her beskriver vi en på stedet elektrokjemiske system for å berike lunsj-kompatible bakterier bruker en anode som en åndedretts terminal elektron acceptor. Denne anoden er koblet til en katode i stand til katalyserende abiotiske oksygen reduksjon. Sammenlignende denne med electrocultivation metoder som bruker en potentiostat for poising elektroden potensielle, krever to elektrode systemet ikke en ekstern strømkilde. Vi presenterer et eksempel vår on-site berikelse benyttet i et alkalisk tjern på sedertrær, et terrestrial serpentinization område i Nord-California. Tidligere forsøk på å dyrke mineral redusere bakterier var mislykket, som er trolig på grunn av lav-biomasse av dette nettstedet eller lav relative overflod av metall redusere mikrober. Før du implementerer våre to elektrode berikelse, målt vi loddrett profilen oppløst oksygen konsentrasjon. Dette tillot oss å plassere karbon følte trioden og platina-galvanisert karbon følte katoden på dybder som ville støtte aerobe og anaerobe prosesser, henholdsvis. Etter hotellets inkubering, vi ytterligere beriket anodic elektroden i laboratoriet og bekreftet en distinkt mikrobiell fellesskapet forhold til overflaten-vedlagt eller biofilm samfunn vanligvis observert på Cedars. Denne berikelse senere førte til isolering av den første electrogenic mikrobe fra sedertrær. Denne metoden på stedet mikrobiell berikelse har potensial til å øke isolering av lunsj-kompatible bakterier lav eller vanskelig å prøve habitater.
Introduction
Flere mineral-reduserende mikrober har vist å utnytte solid-fase mineraler som terminal elektron acceptors, av ekstracellulære elektronet transport (lunsj) prosesser som utfører elektroner på utsiden av cellen via redoks enzymer1. LUNSJ er avgjørende ikke bare for mikrobe-mineral prosesser, men også brukt energi og miljøteknologi, som mikrobielle brenselceller2, elektrode syntese3og bioremediation4. Nye lunsj-kompatible bakterier er svært ettertraktet, og har blitt grundig studert fra grunnleggende eller anvendt perspektiv5. Men har vi bare begrenset innsikt i økologiske eller biogeochemical betydningen av disse bakteriene. Fleste lunsj-kompatible mikrober har vært isolert etter berikelse fra aqua, sediment eller anaerob råtnetanker med solid elektron acceptors som MnO2, Fe2O3 eller klar elektrodene i laboratoriet6, 7 , 8. imidlertid disse metodene ofte produsere lignende konsortier og potensielt savner mer følsomme taxa som kan dominere lav energi eller lav biomasse systemer, biasing evne til disse mikrobene å tilpasse til lab eller axenic kultur miljø9 . Vanligvis for lav biomasse miljøer, er store mengder vann fra et område filtrert for å konsentrere bakterielle celler. Men lunsj-kompatible bakterier oppfører seg ofte anaerob metabolisms og derfor oksygen eksponering kan videre hemme eller hindre deres dyrking. Alternativ på stedet metoder å konsentrere celler uten å utsette dem til oksygen kan forenkle isolering av lunsj-kompatible bakterier. Her rapporterer vi oppsettdetaljer for en stedets elektrokjemiske teknikk å berike lunsj-kompatible mikrobe over en lang periode uten behov for en ekstern strømkilde.
Bruke vår electrocultivation eksperimenter fra en sterkt alkaliske våren i Nord-California, Cedars10, beskrive vi dette stedet elektrokjemiske teknikk. Geokjemi av fjærene på hotellet påvirkes av serpentinization i undergrunnen. Kildene er svært reductive, med Oksygenkonsentrasjoner under grensen for påvisning under luft vann grensesnittet fremhever potensialet for mikrobiell energiproduksjon via lunsj i denne funksjonelt anoksisk miljø11. Men er det ingen bevis for å støtte lunsj-kompatible mikrober fra Cedars (i 16S rRNA eller Metagenomic analyse). Selv om dette miljøet har blitt karakterisert som elektron acceptor begrenset, potensialet for bruk av uløselig mineraler som terminal elektron acceptors, inkludert mineraler som jern baring mineraler som følge av serpentinization (dvs. magnetitt), har ikke grundig undersøkt12. Vi har derfor deployert elektrokjemiske systemet på campingplassen vår, en høy pH våren på sedertrær, å berike for Fornying-kompatible mikrober (figur1)13.
Protocol
Representative Results
Discussion
I beskrevet studien viser vi anriking av en mikrobiell consortium, knyttet i situ gjeldende produksjon. Observerte mønstre i gjeldende mikrobiell aktivitet i systemet over kort og lang tid skalaer. Det avgjørende skrittet for å konstruere en funksjonell to elektrode (brenselcelle type) system er identifisere og utnytte en plassering med en stabil vannstanden og oksygen konsentrasjon i miljøet. Katoden er utsatt for oksygen i luften vann grensesnittet, mens anoden holdes under anaerob tilstand, og elektroden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å erkjenne Roger Raiche og David McCrory gir oss tilgang til Cedars og rådgivning på steder for langsiktig inkubasjon. Vi takker også Cedars feltet mannskapet i 2013-2014 sesongen: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam og Matthew Schechter. Ytterligere Shino Suzuki og Gijs Kuenen for innsiktsfulle forskning og dyrking støtte. Dette arbeidet ble finansiert gjennom en Grant-in-Aid for unge forskere A og B fra Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) KAKENHI Grant nummer 17H 04969 og 26810085, henholdsvis, og Japan byrået for medisinsk forskning og utvikling (17gm6010002h0002). USA midler gitt av det oss Office of Global Naval Research (N62909-17-1-2038) og Center for mørk energi biosfæren undersøkelser (C-DEBI) (OCE0939564) og NASA Davidreiss666 Institute – livet underjordiske (NAI-LU) (NNA13AA92A). Del av dette arbeidet ble gjennomført som del av en Japan Society for fremme av vitenskap: kortsiktige postdoktorstipend for Annette Rowe (PE15019) på Universitetet i Tokyo i laboratoriet av Kazuhito Hashimoto.
Materials
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation. Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).
- Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis – revisiting the electrical route for microbial production. Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).
- Lovley, D. R., Coates, J. D. Bioremediation of metal contamination. Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).
- Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200. Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).
- Rowe, A. R., et al. In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring. Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).
- Suzuki, S., et al. Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).
- Suzuki, S., et al. Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site. Nature Communications. 5, 3900 (2014).
- McCollom, T. M., et al. Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine. Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).
- Morrill, P. L., et al. Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars. Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. . Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells. , 207-222 (2012).
- Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier. Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).
