Самостоятельный электрохимических Set-up обогатить анод дышащие бактерий на месте
Summary
На месте микробной обогащения или на месте выращивания методы могут облегчить изоляции трудных культуры микроорганизмов таксонов, особенно с низким биомассы или geochemically экстремальных средах. Здесь мы описываем электрохимические установки без использования внешнего источника питания для обогащения микробных штаммов, которые способны внеклеточного переноса электронов (EET).
Abstract
Анаэробное дыхание, в сочетании с переноса электронов в нерастворимые минералов (именуемый внеклеточного электронного транспорта [EET]) считается критическим для производства микробных энергии и настойчивости во многих подземных средах, особенно не хватает акцепторов растворимых терминала электрона. Хотя EET-способных микробы были успешно изолированы от различных сред, разнообразие бактерий, способных EET является до сих пор плохо понимает, особенно в трудные для образца, низкой энергии или экстремальных условиях, таких как многие подземные экосистемы. Здесь мы описываем на месте электрохимические системы обогатить EET-способных бактерий с помощью анод как респираторные терминала электрон акцептора. Этот анод подключен к катоду, способный катализировать абиотических кислорода сокращения. Этот подход по сравнению с electrocultivation методами, которые используют потенцио для poising электродный потенциал, двухэлектродное система не требует внешнего источника питания. Мы представляем пример нашего отеля обогащения, используемых в щелочной пруд в кедры, наземные serpentinization сайт в Северной Калифорнии. Ранее попытки культивировать минеральных сокращение бактерии были неудачными, который, вероятно, из-за низкой биомассы характер данного сайта и/или низкой относительное обилие металла, снижения микробов. До внедрения наших двух электрод обогащения, мы измерили вертикальный профиль концентрации растворенного кислорода. Это позволило нам поставить углерода чувствовал, что анод и платины гальваническим углерода чувствовал, что катод на глубинах, поддерживающие анаэробных и аэробных процессов, соответственно. После инкубации на месте мы далее обогащенный анодное электрода в лаборатории и подтвердил различных микробных общины, по сравнению с поверхности придает или биопленки общин обычно наблюдается в кедры. Это обогащение впоследствии привело к изоляции первого electrogenic Микроб от кедры. Этот метод на месте микробной обогащения имеет потенциал, чтобы значительно повысить уровень изоляции EET-способных бактерий от низкой биомассы или трудно образец среды обитания.
Introduction
Несколько минерал сокращение микробы показали использовать твердофазный минералы как терминал электрона акцепторов, внеклеточная переноса электронов (EET) процессов, которые поведения электронов к наружной поверхности клетки через окислительно-восстановительных ферментов1. EET чрезвычайно важно не только для микроба минеральные процессов, но также прикладной энергии и экологических технологий, таких как микробные топливные элементы2, электрод синтеза3и биоремедиации4. Новые EET-способных бактерии высоко ценятся и подробно изучены с точки зрения фундаментальных или прикладных5. Однако мы есть только ограниченное понимание экологических или биогеохимических значимость этих бактерий. Большинство EET-способных микробы были изолированы после обогащения от Аква, отложениях или анаэробных варочных котлов с помощью твердых электрона акцепторов MnO2, Fe2O3 или готовы электродов в лаборатории6, 7 , 8. Однако, эти методы часто производят аналогичные консорциумов и потенциально пропустить более чувствительных таксонов, которые могут доминировать низкой энергии или систем низкой биомассы, стабилизатор эти микробы способность адаптироваться к лаборатории или стерильных культуры окружающей среды9 . Обычно для сред низком биомассы, большое количество воды из сайта фильтруются сконцентрировать бактериальной клетки. Однако EET-способных бактерии часто exhibit анаэробных метаболизмом и поэтому воздействия кислорода может далее тормозить или предотвращения их выращивания. Альтернативные методологии на месте сконцентрировать клетки не подвергая их воздействию кислорода может способствовать изоляции EET-способных бактерий. Здесь мы приводим детали установки для занятия электрохимический способ обогатить EET-способных микроба в течение длительного периода времени без необходимости использования внешнего источника питания.
С помощью нашего electrocultivation экспериментов с сильно щелочной весны в Северной Калифорнии, кедры10, мы описываем этой территории электрохимической техники. Геохимия Спрингс в Кедры подвержены serpentinization в недрах. Источники весьма упрощенной, с концентрации кислорода ниже предела обнаружения под интерфейс воды воздуха, отметив потенциал для производства микробных энергии через EET в этом функционально анаэробной среды11. Однако нет никаких доказательств в поддержку EET-способных микробов из кедров (в 16S рРНК или метагеномных анализ). Даже несмотря на то, что эта среда было охарактеризовано как электрон акцептора ограниченный, потенциал использования нерастворимых минералы как терминал электрона акцепторов, включая такие минералы, как железо, обнажая минералы, которые приводят к от serpentinization (то есть, Магнетит), не были всесторонне исследованы12. Мы, таким образом, развертывание нашей электрохимические системы в кемпинге весной, высокий рН Весна в кедры, чтобы обогатить EET-способных микробов (рис.1)13.
Protocol
Representative Results
Discussion
В исследовании описано мы показываем обогащения микробной консорциума, связаны с на месте текущего производства. Наблюдаемые закономерности в текущей поддержки активности микроорганизмов в этой системе более короткие и долгое время весы. Важным шагом для построения функциональ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы признать Роджер Raiche и Дэвид Маккрори, позволяя нам доступ к кедры и консультаций на местах для долгосрочной перспективе инкубации. Мы также благодарим экипаж поля кедры в течение сезона 2013-2014: Shino Suzuki, Сунити Ишии, Грег Вангер, Grayson Chadwick, Bonita Лам и Мэтью Шехтер. Дополнительные благодаря Shino Судзуки и Куэнен Хайс для глубоких исследований и культивирования поддержки. Эта работа финансируется за счет субсидий для молодых ученых, A и B от японского общества для поощрения науки (JSP) KAKENHI Грант № 17H, 04969 и 26810085, соответственно и Японское агентство для медицинских исследований и развития (17gm6010002h0002). США финансирование нас управлением глобальной военно-морских исследований (N62909-17-1-2038), и центром для темной энергии биосферы расследований (C-Деби) (OCE0939564) и Института астробиологии NASA – подземной жизни (Най-Лу) (NNA13AA92A). Частью этой работы проводилась в рамках японского общества для поощрения наук: краткосрочные докторантура стипендий для Аннет Роу (PE15019) в университете Токио в лаборатории Кадзухито Хасимото.
Materials
| Carbon felt sheet | n/a | n/a | Used for anode and cathode |
| Titanium wire | The Nilaco Cooporation | TI-451485 | Used to construct fuel cell system |
| Graphite epoxy | Electrolytica lnc. | n/a | Used to connect the electrodes and Ti wire |
| Drying oven | Yamato | DY300 | bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy |
| Digital multi meter | Fluke | 616-1454 | to check the ohmic value of resistance |
| Dissolved oxygen probe | Sper Science | # 850045 | to check the oxygen concentration in the environments |
| Resistor | Sodial | Used to construct fuel cell system |
|
| Conducting wire | Pico | 81141s | Used to construct fuel cell system |
| Voltmeter and Data logger | T&D corporation | VR-71 | Used for data recording |
| Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate | wako | 18497-13-7 | Used for electropolation |
| Citric acid | Wako | 038-06925 | Used for electropolation |
| Sulfuric acid | Wako | 192-04696 | Used for electropolation |
| HCl | Wako | 083-01095 | Used for electrode washing |
| Glass cylinder | N/A | N/A | Custom-made, used as the electrochemical reactor |
| PTFE cover and base | N/A | N/A | Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor |
| Buthyl rubber | N/A | N/A | Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor |
| Septa | GL Science | 3007-16101 | Used as an injection port of electrochemical reactor |
| Indium tin-doped oxide (ITO) electrode | GEOMATEC | No.0001 | Used as a working electrode, 5Ω/sq |
| Ag/AgCl KCl saturated electrode | HOKUTO DENKO | HX-R5 | Used as a reference electrode, Φ0.30mm |
| Platinum wire | The Nilaco Cooporation | PT-351325 | Used as a counter electrode |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | Used for The Cedars Media (CMS) |
| CaCO3 | Wako | 030-00385 | Used for CMS |
| NH4Cl | Wako | 011-03015 | Used for CMS |
| MgCl2 • 6H2O | Wako | 135-00165 | Used for CMS |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Used for CMS |
| Na2SO4 | Wako | 194-03355 | Used for CMS |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | Used for CMS |
| CABS | SANTA CRUZ | SC-285279 | Used for CMS |
| Incubator | TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD. | LTI-601SD | Used for precultivation |
| Autoclave machine | TOMY SEIKO CO. LTD. | LSX-500 | Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium |
| Clean bench | SANYO | MCV-91BNF | Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes |
| Centrifuge separator | Eppendorf | 5430R | Rotational speed upto 6000×g is required |
| Nitrogen gas generator | Puequ CO. LTD. | PNTN-2 | Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator |
| UV-vis spectrometer | SHIMADZU | UV-1800 | Used for optimization of cell density |
| Potentiostat | BioLogic | VMP3 | Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments |
| Thermal water circulator | AS ONE | TR-1A | Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor |
| Faraday cage | HOKUTO DENKO | HS-201S | Used for electrochemical experiments |
| Anaerobic Chamber | COY | TypeB (Vinyl) | TO conduct experiments under anaerobic condition |
| Ultraclean DNA Extraction kit | MoBio |
References
- Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation. Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).
- Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).
- Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis – revisiting the electrical route for microbial production. Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).
- Lovley, D. R., Coates, J. D. Bioremediation of metal contamination. Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).
- Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
- Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).
- Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200. Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).
- Rowe, A. R., et al. In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring. Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).
- Suzuki, S., et al. Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).
- Suzuki, S., et al. Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site. Nature Communications. 5, 3900 (2014).
- McCollom, T. M., et al. Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine. Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).
- Morrill, P. L., et al. Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars. Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).
- Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
- Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. . Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells. , 207-222 (2012).
- Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier. Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).
