Her presenterer vi en detaljert protokoll for å skille menneskelig pluripotent stamceller (hPSCs) i bukspyttkjertelen/tolvfingertarmen homeobox protein 1+ (PDX1+) celler for generering av bukspyttkjertelen overleveringslinjer basert på ikke-kolonien type monolayer av dissosiert enkeltceller. Denne metoden er egnet for produksjon av homogene hPSC-avledet celler, genetisk manipulasjon og screening.
Menneskelige pluripotent stilk cellen (hPSC)-avledede bukspyttkjertelen celler er en lovende celle kilde for regenerativ medisin og en plattform å studere human utviklingsprosesser. Trinnvis rettet differensiering som viser utviklingsprosesser er en av de viktigste måtene å generere bukspyttkjertelen celler inkludert bukspyttkjertelen/tolvfingertarmen homeobox protein 1+ (PDX1+) bukspyttkjertelen progenitor celler. Konvensjonelle protokoller starte differensiering med små kolonier kort tid etter passering. Men i delstaten colonies eller aggregater, celler er utsatt for heterogeneities, som kan hemme differensiering å PDX1+ celler. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å skille hPSCs i PDX1+ celler. Protokollen består av fire trinnene og starter differensiering av seeding dissosiert enkeltceller. Induksjon av SOX17+ definitive endoderm celler ble etterfulgt av uttrykk for to primitive gut tube markører, HNF1β og HNF4α og eventuell differensiering inn PDX1+ celler. Nåværende protokollen gir enkel håndtering og kan forbedre og stabilisere differensiering effektiviteten av noen hPSC linjer som tidligere ble funnet for å skille ineffektivt endodermal linjene eller PDX1+ celler.
Bukspyttkjertelen består hovedsakelig av exocrine og endokrine celler, og dens dysfunksjon eller overbelastning fører flere sykdommer, for eksempel pankreatitt, diabetes og kreft i bukspyttkjertelen. For å klargjøre pathogeny av pancreatopathy, er det nødvendig å analysere utviklingsprosess og funksjon av bukspyttkjertelen celler. I tillegg er en stabil celle forsyning med robuste kvalitet nødvendig å etablere cellen/vev kosttilskudd terapi. Menneskelige pluripotent stilk cellen (hPSC)-avledede bukspyttkjertelen celler er en lovende celle-kilde til disse formålene, og differensiering protokollen mot bukspyttkjertelen celler har vært intenst studerte1,2,3, 4. Nylige fremskritt i bukspyttkjertelen β celler i vitro generasjon etterligne generering av β celler i voksen menneskelige og disse cellene Vis terapeutiske effekten på implantasjon i diabetiker modell mus2,3. I tillegg avdekket analyse av β celler generert fra indusert pluripotent stamceller (iPSCs) av sunn og type 1 diabetes pasient givere ingen funksjonell forskjell inkludert når under stress5. Videre har sykdom fenotyper blitt delvis gjengitt i indusert bukspyttkjertelen celler med pasient-avledede iPSCs eller hPSCs skjuler genetiske mutasjoner i samme område som pasienter6,7.
Vil generere bukspyttkjertelen celler fra hPSCs, brukes gradvis rettet differensiering som viser utviklingsprosesser. Bukspyttkjertelen er avledet fra endoderm laget av tidlig embryoet, som uttrykker sex bestemme regionen Y-boksen 17 (SOX17) og forkhead for A2 (FOXA2)8. Basert på undersøkelsene vi musen, danner det endodermal laget primitive gut røret, som er preget av uttrykk for hepatocyte kjernefysiske faktor 1-beta (Hnf1β) og hepatocyte kjernefysiske faktor 4-alpha (Hnf4α). Den primitive gut elongates og utvikler i luftveiene apparater, fordøyelseskanal og organer. Etter elongation, bakre foregut området blir presumptive bukspyttkjertelen regionen, som preget av uttrykk for transcriptional faktor bukspyttkjertelen/tolvfingertarmen homeobox protein 1 (PDX1)8,9,10. Rygg- og ventrale deler av PDX1+ gut tube tykne til skjemaet bukspyttkjertelen knopper, som er preget av co uttrykk for bukspyttkjertelen transkripsjon faktor 1 delenhet alpha (PTF1A) og NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Denne uttrykket markerer morfologiske starten av bukspyttkjertelen organogenesen. Bukspyttkjertelen endoderm celler, som er komponenter av bukspyttkjertelen knopper, danner et forgrenet rørformede nettverk epithelial strukturer12 og til slutt skille ut exocrine og endokrine cellene, inkludert insulin sekresjon β-celler og glukagon-sekresjon α-celler. Uttrykk for PDX1 er oppdaget først på presumptive bukspyttkjertelen regionen, som deretter observeres under hele bukspyttkjertelen utviklingen, og viser lokaliseringen å β – og ses-celler9,13,14. Selv om Pdx1+ celle området som ikke uttrykker Ptf1a eller Nkx6.1 skiller den gastriske antrum, tolvfingertarmen, extrahepatic galle duct og noen intestinal celler på midten sent Stadium i utviklingen i mus9PDX1+ celler anses progenitors av bukspyttkjertelen på det tidlige utviklingen scenen hos mennesker.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å skille hPSCs i PDX1+ celler for generering av bukspyttkjertelen overleveringslinjer. Protokollen starter differensiering av seeding dissosiert enkeltceller15,16,17. Vanligvis vedlikeholdes udifferensierte hPSCs som kolonier eller cellen aggregater i suspensjon eller vedheft. Som et resultat, starte de fleste protokollene differensiering etter passaging. Men i delstaten colonies eller aggregater, celler er utsatt for romlige og transcriptional heterogeneities18,19,20,21,22, som kan hemme den første differensiering skritt mot definitive endoderm etterfulgt av ineffektiv differensiering til PDX1+ celler. Nåværende protokollen kan tilby enkel håndtering for å forbedre og stabilisere differensiering effektiviteten av noen hPSC linjer som tidligere ble funnet for å skille ineffektivt å endodermal linjene og PDX1+ celler23, 24 , 25.
Generering av PDX1+ celler består av flere trinn; Derfor er det avgjørende å behandle celler på riktig tidspunkt. Blant trinnene, induksjon effektiviteten definitive endoderm i stor grad påvirker siste induksjon effektiviteten, muligens av interferens fra andre forurensende avstamning celler (dvs. mesoderm og ektoderm), som kan spre og/eller skiller faktorer som forstyrre bestemt differensiering. Hvis andelen SOX17+ celler er lavere enn 80% på dag 4 (trinn 1B), en effektiv induksjon til PDX1<s…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet var støttes delvis av finansiering fra Japan Society for det fremme av vitenskap (JSPER) gjennom Scientific Research (C) (Javaserver KAKENHI Grant Number15K09385 og 18 K 08510) T.T. og Grant-in-Aid for stipendiater for JSP (Javaserver KAKENHI bevilgning nummer 17J07622) AK og Japan Direktoratet for medisinsk forskning og utvikling (AMED) gjennom sin forskning gi “Core Center for iPS forskning, Research Center nettverk for realisering av regenerativ medisin” K.O. Forfatterne takker Dr. Peter Karagiannis for å lese manuskriptet.
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
Latex Examination Gloves | Adachi | ||
MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
Microtube | Watoson | 131-515CS | |
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
Y-27632 | Wako | 251-00514 |