יעיל הדור של הלבלב/תריסריון גנים Homeobox חלבון 1+ אבות הלבלב במעי הקדמי/אחורי של hPSCs בתרבויות אדהזיה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחין בתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) לתוך הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) תאים עבור הדור של שושלות הלבלב בהתבסס על הגידול חד שכבתי ללא-המושבה סוג של חלופה מועדפת תאים בודדים. שיטה זו מתאימה בהפקת הומוגנית נגזר hPSC תאים, מניפולציה גנטית וסינון.
Abstract
תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר בתאי הלבלב הם מקור תא מבטיח עבור רפואה רגנרטיבית ופלטפורמה ללמוד תהליכים פיתוחיים אנושי. Stepwise ביים בידול זה recapitulates תהליכים פיתוחיים היא אחת הדרכים הגדולות ביותר ליצירת תאי הלבלב כולל הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) ובתאים הלבלב. פרוטוקולים קונבנציונאלי ליזום את הבידול עם מושבות קטנות זמן קצר לאחר המעבר. עם זאת, במצב של מושבות או אגרגטים, התאים הם נוטים heterogeneities, אשר ייתכן ה”בלתי הבידול כדי PDX1+ תאים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להתמיין hPSCs PDX1+ תאים. הפרוטוקול כוללת ארבעה שלבים ויוזמת את הבידול על ידי תאים בודדים הפומבית זריעה. אינדוקציה של SOX17+ תאים האנדודרם סופית בעקבות הביטוי של סמנים צינור שני הבטן פרימיטיבית, HNF1β, HNF4α, בידול בסופו של דבר לתוך PDX1+ תאים. בפרוטוקול הנוכחי מספק טיפול קל, עשוי לשפר ולייצב את היעילות בידול של כמה שורות hPSC שנמצאו בעבר להבדיל באופן לא יעיל שושלות endodermal או PDX1+ תאים.
Introduction
הלבלב מורכבת בעיקר תאים האנדוקרינית אקסוקרינית, תפקוד לקוי או עומס יתר שלה גורם מספר מחלות, כמו לבלב, סוכרת וסרטן הלבלב. התירי את pathogeny של pancreatopathy, יש צורך לנתח את תהליך התפתחותי והתפקוד של תאים בלבלב. בנוסף, היצע תא יציב עם איכות נדרש להקים תא/רקמות תוספת של טיפול. תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר בתאי הלבלב הם מקור תא מבטיח למטרות אלו, פרוטוקול בידול כלפי בתאי הלבלב כבר למד באופן אינטנסיבי1,2,3, 4. התפתחויות אחרונות הדור במבחנה של תאי β בלבלב לחקות את הדור של תאי β אדם מבוגר, תאים אלה הצג יעילות טיפולית על ההשתלה לתוך מודל סוכרתית-עכברים-2,–3. בנוסף, ניתוח הנתונים של תאי β שנוצר בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) של בריאה, תורמים לחולה סוכרת סוג 1 גילה אין הבדלים תפקודיים כולל כאשר תחת מתח5. יתר על כן, המחלה פנוטיפים כבר חלקית שפירטתי ב המושרה בתאי הלבלב עם המטופל, נגזר iPSCs או hPSCs מחסה מוטציות גנטיות באותו אתר כמו המטופלים6,7.
לייצר תאי הלבלב hPSCs, משמש stepwise התמיינות מכוונת את recapitulates תהליכים התפתחותיים. הלבלב נגזרת לשכבת האנדודרם של העובר מוקדם, המבטאת סקס קביעת אזור Y-box 17 (SOX17) ו- forkhead תיבת A2 (FOXA2)8. על סמך המחקרים העכבר, השכבה endodermal טפסים ברכבת התחתית בטן פרימיטיבי, אשר מסומנת על ידי הביטוי של hepatocyte גרעיני גורם 1-בטא (Hnf1β) ו- 4 גרעיני גורם hepatocyte-alpha (Hnf4α). הצינור בטן פרימיטיביים מאריך ומפתחת לתוך מערכת הנשימה, מערכת העיכול, איברים. לאחר התארכות, האזור האחורי במעי הקדמי הופך האזור הלבלב הרב, שעורר, לפי המסומן על-ידי הביטוי של החלבון פקטור תעתיק הלבלב/תריסריון גנים homeobox 1 (PDX1)8,9,10. החלקים הגבי ו הגחון של PDX1+ בטן צינור לעבות את הטופס ניצנים הלבלב, אשר מסומנים על-ידי הביטוי שיתוף של הלבלב שעתוק מקדם 1 יחידה משנית אלפא (PTF1A), NK6 גנים homeobox (NKX6.1) 18,11. ביטוי זה מסמן את תחילת מורפולוגיים organogenesis הלבלב. תאי הלבלב האנדודרם, שהם מרכיבים של בלוטות הלבלב, יוצרים רשת צינורי מסועף של מבנים אפיתל12 , להבדיל בסופו של דבר לתוך תאים האנדוקרינית אקסוקרינית, לרבות תאי-β הורמון האינסולין, α מפריש גלוקגון-תאים. הביטוי של PDX1 הוא זוהה לראשונה אצל הרב, שעורר באזור הלבלב, אשר נצפית ואז במהלך פיתוח הלבלב כולו ומראה לוקליזציה β-אלפא-תאים ו9,13,14. למרות Pdx1+ אזור תא המבטאים לא Ptf1a או Nkx6.1 מבדילה את antrum קיבה, תריסריון, צינור המרה extrahepatic ואת מספר תאים מעיים באמצע לשלב מאוחר של התפתחות אצל עכברים9, PDX1+ תאים נחשבים המוצא לאגס התרבותי הלבלב בשלב התפתחותי מוקדם אצל בני אדם.
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להתמיין hPSCs PDX1+ תאים לדור של שושלות הלבלב. הבידול יוזם פרוטוקול על ידי זריעה הפומבית תאים בודדים15,16,17. באופן כללי, hPSCs מובחן מתוחזקים מושבות או אגרגטים תא השעיה או אדהזיה. כתוצאה מכך, ברוב הפרוטוקולים ליזום את הבידול זמן קצר לאחר passaging. עם זאת, במצב של מושבות או אגרגטים, התאים הם נוטים המרחבי, תעתיק heterogeneities18,19,20,21,22, אשר ייתכן ה”בלתי בידול צעד לקראת סופי האנדודרם ואחריו בידול לא יעיל כדי PDX1+ תאים. בפרוטוקול הנוכחי עשוי להציע טיפול קל כדי לשפר ולייצב את היעילות בידול של כמה שורות hPSC שנמצאו בעבר להבדיל באופן לא יעיל שושלות endodermal, PDX1+ תאים23, 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדור של PDX1+ תאים מורכבת מרובי שלבים; לכן, חיוני לטיפול תאי בזמן המתאים. בין הצעדים, יעילות אינדוקציה האנדודרם סופי משפיע במידה רבה את היעילות אינדוקציה הסופי, יכול להיות הפרעה מזהמים שושלת היוחסין תאים אחרים (קרי, והמזודרם ו האאקטודרם), אשר עשוי להתרבות ו/או מפרישים על ידי גורמים לשבש ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מימון מן האגודה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) דרך Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI גרנט Number15K09385 ו- 18 K 08510) טי, מענק הסיוע עבור עמיתי מחקר JSPS (מספר גרנט KAKENHI של JSPS 17J07622) משום מקום, ועבור הסוכנות יפן למחקר רפואי, פיתוח (AMED) באמצעות המחקר שלה להעניק “מרכז הליבה עבור שב”ס תא מחקר, מרכז מחקר ברשת המימוש של רפואה רגנרטיבית”בנוקאאוט המחברים תודה ד ר פיטר Karagiannis לקרוא את כתב היד.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
