Efficiente generazione di Pancreas/duodeno Homeobox Protein 1+ posteriore del Foregut/pancreatico progenitori da hPSCs nelle culture di adesione
Summary
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in proteina di pancreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas basano sulla crescita di monostrato di tipo non-Colonia di dissociato singole cellule. Questo metodo è adatto per la produzione di cellule derivate da hPSC omogenee, manipolazione genetica e di screening.
Abstract
Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per la medicina rigenerativa e una piattaforma per lo studio di processi di sviluppo umani. Diretto graduale differenziazione che ricapitola i processi inerenti allo sviluppo è uno dei principali modi per generare cellule pancreatiche compreso pancreas/duodeno homeobox proteina 1+ (PDX1+) cellule progenitrici del pancreas. Protocolli convenzionali avviano la differenziazione con piccole colonie poco dopo il passaggio. Tuttavia, nello stato di colonie o aggregati, le cellule sono inclini a eterogeneita ‘, che potrebbero ostacolare la differenziazione per PDX1+ cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziarsi hPSCs in PDX1+ cellule. Il protocollo consiste di quattro passi e avvia la differenziazione di singole cellule dissociate di semina. L’induzione di SOX17+ cellule endoderma definitivo è stata seguita dall’espressione di marcatori di tubo due intestino primitivo, HNF1β e HNF4α ed eventuale differenziazione in PDX1+ cellule. Il presente protocollo fornisce la gestione facile e può migliorare e stabilizzare l’efficienza di differenziazione di alcune linee di hPSC che precedentemente sono stati trovati per differenziare in modo inefficiente in endodermici lignaggi o PDX1+ cellule.
Introduction
Il pancreas è costituito principalmente da cellule esocrine ed endocrine, e sua disfunzione o sovraccarico provoca diverse malattie, come la pancreatite, diabete e cancro del pancreas. Per delucidare il pathogeny di fibrocalcolosa, è necessario analizzare il processo di sviluppo e la funzione delle cellule pancreatiche. Inoltre, per stabilire la terapia di supplementazione di cellule/tessuti è necessaria una fornitura di cellulari stabili con qualità robusta. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per questi scopi, e il protocollo di differenziazione verso le cellule del pancreas è stato intensamente studiato1,2,3, 4. Gli avanzamenti recenti nella generazione in vitro di cellule β del pancreas imitano la generazione di cellule β in adulto umano e queste cellule Visualizza efficacia terapeutica su impiantati in topi diabetici modello2,3. Inoltre, l’analisi delle cellule β generate dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di sano di tipo 1 diabete paziente donatori ha rivelato nessuna differenza funzionale tra cui quando sotto stress5. Inoltre, i fenotipi di malattia sono stati riprodotti parzialmente in cellule pancreatiche indotte con iPSCs derivate dal paziente o hPSCs che harboring le mutazioni genetiche nello stesso sito come pazienti6,7.
Per generare le cellule pancreatiche da hPSCs, graduale differenziazione diretto che ricapitola i processi di sviluppo viene utilizzata. Il pancreas è derivato dallo strato endoderma dell’embrione precoce, che esprime il sesso che determina regione Y-box 17 (SOX17) e forkhead box A2 (FOXA2)8. Basato sugli studi del mouse, lo strato endodermico forma il tubo dell’intestino primitivo, che è contrassegnato dall’espressione dell’epatocita fattore nucleare 1 beta (Hnf1β) e dell’epatocita nucleare di fattore 4-alfa (Hnf4α). Il tubo dell’intestino primitivo si allunga e si sviluppa nell’apparato respiratorio, digerente e organi. Dopo l’allungamento, la zona posteriore del foregut diventa la regione pancreatica presuntiva, come indicato dall’espressione della proteina fattore trascrizionale pancreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. Le parti dorsali e ventrali della PDX1+ gut tubo addensare a formare cime del pancreas, che sono segnati dalla co-espressione del pancreas trascrizione fattore 1 subunità alfa (PTF1A) e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Questa espressione segna l’inizio morfologico dell’organogenesi pancreatica. Cellule pancreatiche endoderma, che sono componenti delle gemme del pancreas, formano una rete ramificata tubolare di strutture epiteliali12 e alla fine differenziarsi in cellule esocrine ed endocrine, tra cui β-cellule secernenti insulina e che secernono glucagone α-cellule. Espressione di PDX1 viene rilevato in primo luogo alla regione pancreatica presuntiva, che poi è osservata durante l’intero sviluppo del pancreas e Mostra la localizzazione di cellule β – e δ-9,13,14. Anche se il Pdx1+ zona delle cellule che non esprimono Ptf1a o Nkx6.1 differenzia in antrum gastrico, del duodeno, dei dotti biliari extrahepatic e alcune cellule intestinali a metà alla fine della fase di sviluppo in topi9, PDX1+ le cellule sono considerate i progenitori del pancreas nella fase iniziale dello sviluppo negli esseri umani.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziarsi hPSCs in PDX1+ cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas. La differenziazione di iniziati di protocollo da semina dissociato celluli15,16,17. In genere, indifferenziato hPSCs sono mantenuti come colonie o aggregati cellulari in sospensione o in adesione. Di conseguenza, la maggior parte dei protocolli avviare la differenziazione poco dopo il passaggio. Tuttavia, nello stato di colonie o aggregati, le cellule sono inclini a eterogeneità spaziale e trascrizionale18,19,20,21,22, che potrebbero ostacolare la primo passo di differenziazione verso l’endoderma definitivo seguita da differenziazione inefficiente per PDX1+ cellule. Il presente protocollo può offrire maneggevolezza per migliorare e stabilizzare l’efficienza di differenziazione di alcune linee di hPSC che precedentemente sono stati trovati per differenziare inefficacemente endodermici lignaggi e PDX1+ cellule23, 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generazione di PDX1+ cellule è composto da più passaggi; Pertanto, è fondamentale per il trattamento di cellule al momento opportuno. Tra i passaggi, l’efficienza di induzione dell’endoderma definitivo colpisce in gran parte l’efficienza finale induzione, possibilmente da interferenze provenienti da altre cellule lignaggio contaminanti (cioè, mesoderma ed ectoderma), che possono proliferare e/o secernono fattori che compromettere la differenziazione specifica. Se la proporzione di SOX17+ cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato in parte sostenuto da finanziamenti della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) attraverso Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 e 18 K 08510) al T.T. e sovvenzione per assegnisti di ricerca pagine JSP (Javaserver KAKENHI Grant numero 17J07622) di A.K. e l’Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo (AMED) attraverso la sua ricerca concedere “Core Center for iPS Cell ricerca, centro di ricerca rete per realizzazione di medicina rigenerativa” per K.O. Gli autori ringraziano il Dr. Peter Karagiannis per leggere il manoscritto.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
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