Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence
Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule pour la médecine régénérative et une plate-forme pour l’étude des processus de développement humains. Réalisé par étapes de différenciation qui récapitule les processus de développement est un des principaux moyens pour générer des cellules pancréatiques y compris pancréas/duodénum homéotique protéine 1+ (PDX1+) des cellules progénitrices pancréatiques. Les protocoles classiques initient la différenciation avec petites colonies peu après le passage. Toutefois, dans l’état de colonies ou d’agrégats, les cellules sont sujettes aux hétérogénéités, qui pourraient entraver la différenciation à PDX1+ cellules. Nous présentons ici un protocole détaillé pour se différencier de hPSCs en PDX1+ cellules. Le protocole consiste en quatre étapes et initie la différenciation par ensemencement monocellules dissociées. L’induction de SOX17+ cellules de l’endoderme définitif a été suivie par l’expression des marqueurs de tube deux intestin primitif, HNF1β et HNF4α et différenciation éventuelle en PDX1+ cellules. Le présent protocole offre une manipulation facile et peut améliorer et stabiliser l’efficacité de différenciation de certaines lignées de hPSC qui ont été précédemment trouvés à se différencier de manière inefficace en lignées endodermiques ou PDX1+ cellules.
Introduction
Le pancréas se compose principalement de cellules exocrines et endocrines et son dysfonctionnement ou surcharge provoque plusieurs maladies comme la pancréatite, le diabète et le cancer du pancréas. Afin d’élucider la pathogénie de le pancreatopathy, il est nécessaire d’analyser le processus de développement et la fonction des cellules du pancréas. En outre, une alimentation de variétés de cellule stables avec qualité robuste est nécessaire pour établir la thérapie de supplémentation de cellules/tissus. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule à ces fins, et le protocole de différenciation vers les cellules du pancréas a été intensivement étudiée1,2,3, 4. Les progrès récents dans la production in vitro de cellules β pancréatiques imitent la génération des cellules β homme adulte et ces cellules voir la thérapeutique sur l’implantation dans les diabétiques modèle souris2,3. En outre, l’analyse des cellules β générés par la les cellules souches pluripotentes induites (CISP) de sain et de type 1 diabetes patients donateurs a révélé aucune différence fonctionnelle y compris quand il est sous tension5. En outre, phénotypes de la maladie ont été partiellement reproduites dans les cellules pancréatiques induites avec CISP dérivé de patient ou hPSCs hébergeant des mutations génétiques dans le même site que les patients6,7.
Pour générer des cellules pancréatiques de hPSCs, la différenciation dirigée par étapes qui récapitule les processus de développement est utilisée. Le pancréas est dérivé de la couche de l’endoderme de l’embryon précoce, qui exprime la région Y-box 17 (SOX17) de détermination du sexe et de forkhead box A2 (FOXA2)8. Se fondant sur les études sur les souris, la couche endoderme forme le tube de l’intestin primitif, qui se caractérise par l’expression du facteur nucléaire hépatocytaire 1 bêta (Hnf1β) et le facteur nucléaire hépatocytaire 4 alpha (Hnf4α). Le tube de l’intestin primitif s’allonge et se développe dans l’appareil respiratoire, digestif et des organes. Après l’allongement, la zone de l’intestin postérieur devient la région pancréatique présumée, comme marqué par l’expression de la protéine de boîte homéotique de pancréas/duodénum de facteur de transcription 1 (PDX1)8,9,10. Les parties ventrales et dorsales de le PDX1+ gut tube épaissir à bourgeons pancréatiques de forme, qui sont marqués par la co-expression de pancréas transcription factor 1 sous-unité alpha (PTF1A) et NK6 boîte homéotique 1 (NKX6.1)8,11. Cette expression marque le début morphologique de l’organogenèse du pancréas. Les cellules pancréatiques endoderme, qui sont des composants des bourgeons pancréatiques, forment un réseau tubulaire ramifié de structures épithéliales12 et finalement se différencient en cellules exocrines et endocrines, dont les cellules insulino-sécrétrices β et α-cellules qui sécrètent du glucagon. Expression de PDX1 est détectée tout d’abord à la région pancréatique présumée, qui est ensuite observée tout au long de tout le développement du pancréas et montre la localisation de cellules β et δ9,13,14. Bien que le Pdx1+ zone de cellule qui n’exprime pas Ptf1a ou Nkx6.1 se différencie dans l’antre gastrique, duodénum, biliaires extrahépatiques et certaines cellules de l’intestin au milieu d’un stade avancé du développement chez la souris9, PDX1+ les cellules sont considérés comme les ancêtres du pancréas aux premiers stades du développement chez l’homme.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour se différencier de hPSCs en PDX1+ cellules pour la génération des lignées du pancréas. La protocole initiés différenciation par ensemencement dissocié monocellules15,16,17. Généralement, hPSCs indifférenciées sont mémorisées dans des colonies ou des agrégats de cellules en suspension ou en adhérence. En conséquence, la plupart des protocoles initient la différenciation peu après le passage. Toutefois, dans l’état de colonies ou d’agrégats, les cellules sont sujettes à des hétérogénéités spatiales et transcriptionnelle18,19,20,21,22, qui pourrait entraver la première étape de différenciation vers endoderme définitif suivie de différenciation inefficace à PDX1+ cellules. Le présent protocole peut proposer un maniement facile pour améliorer et stabiliser l’efficacité de différenciation de certaines lignées de hPSC qui ont été précédemment trouvées pour différencier inefficacement de lignées endodermiques et PDX1+ cellules23, 24 , 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
La génération de PDX1+ cellules se compose de plusieurs étapes ; par conséquent, il est essentiel de traiter les cellules au moment opportun. Parmi les mesures, l’efficacité de l’induction de l’endoderme définitif dans une large mesure affecte l’efficacité de l’induction final, éventuellement par l’interférence des autres cellules de lignée contaminantes (mésoderme et ectoderme), qui peuvent proliférer et/ou sécrètent des facteurs qui perturber la différenciation spécifique. Si la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par le financement de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) par l’intermédiaire de Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 et 18 K 08510) à T.T. et subvention pour les chargés de recherche de pages jsp (jsp KAKENHI Grant Number 17J07622) A.K. et l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED) par le biais de ses travaux de recherche accordent « Core Center for iPS Cell Research, centre de recherche de réseau pour la réalisation de la médecine régénérative » à K.O. Les auteurs remercient Dr Peter Karagiannis pour la lecture du manuscrit.
Materials
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
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