Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента
Summary
Здесь мы описываем протокол для исследования prenylation и 5′-гуанозинтрифосфатом (GTP)-Загрузка Rho ГТФазы. Этот протокол состоит из двух подробных методов, а именно мембраны фракционирования и связаны ГТФазы иммуноферментного анализа. Протокол может использоваться для измерения prenylation и GTP загрузки различных других малых GTPases.
Abstract
Rho ГТФазы семья принадлежит к надсемейства ран и включает в себя около 20 членов в организме человека. GTPases Ро имеют важное значение в регуляции различных клеточных функций, включая цитоскелета динамики, подвижности клеток, клеток полярности, аксональное руководство, везикулярной людьми и клеточного цикла управления. Изменения в Rho ГТФазы сигнализации играют важную роль регулирования в многих патологических состояний, таких как рак, заболевания центральной нервной системы и иммунной системы зависимых заболеваний. Посттрансляционная модификация Ро GTPases (то есть, prenylation, интермедиатов мевалоната путь) и GTP привязки являются ключевыми факторами, которые влияют на активации этого белка. В этом документе две основные и простые методы предоставляются для выявления широкого спектра Rho ГТФазы prenylation и GTP привязку деятельности. Разъясняются детали технических процедур, которые использовались шаг за шагом в этой рукописи.
Introduction
Ро GTPases представляют собой группу небольших белков (21-25 кДа), которые хорошо сохраняются на протяжении эволюции и образуют уникальный подсемейство в РАН надсемейство малых GTPases. В каждом подсемейство в пределах этого надсемейства существует общий G домена ядро, которое участвует в деятельности ГТФазы и нуклеотидов обмен1. Разница между Ро семьи и других подсемейств РАН является наличие «Ро Вставка домена» в рамках 5й β прядь и 4й α спирали в небольшой ГТФазы домена2.
Основываясь на недавних классификации, Ро GTPases считаются семейство сигнализации белки, которые вписываются в Ras ГТФазы надсемейства3. У млекопитающих Ро GTPases имеют 22 членов, основанный на их конкретные функции и общая характеристика4 , в котором RhoA, Rac1 и Cdc42 являются членами наиболее учился в этой группе. GTPases Ро, связаны с внутриклеточных сигнальных путей через жестко регулируемых механизм, который зависит от молекулярных переключателей через белка Посттрансляционная модификации5.
GTP загрузки и гидролиза основных механизмов активации/деактивации цикла малых Ро GTPases и регулируется через ГТФазы активации белков (пробелы). Пробелы отвечают за гидролиза ГТФ и работать во взаимодействии с гуаниновых нуклеотидов обмен факторов (GEFs) которые отвечают за реакции GTP-загрузки. Ро ВВП диссоциации ингибиторы (GDIs) предоставлять ВВП прыгните Ро GTPases дальнейшее регулирование малых GTPases Ро через привязки. Это препятствует ВВП диссоциации и облегчает поглощения из небольших GTPases Ро от сайтов активных внутриклеточные мембраны. Существует также дальнейшее регулирование Rho ГТФазы белков, с участием prenylation GDIs, который регулирует гидролизе нуклеотида и обмена и управления ВВП/GTP Велоспорт1,6,,78.
GTP-загрузки и Rho ГТФазы prenylation участвуют в движение Rho ГТФазы между цитозоле и клеточных мембран, изменяя липофильных свойств этих белков1,9. Вышеупомянутые регуляторы взаимодействуют с фосфолипиды мембраны клетки и другие модулирующих белки ВВП/GTP обмен деятельности10. Кроме того GDIs, диссоциация ингибиторы, блокировать гидролиз ГТФ и ВВП/ГТУ обмен. GDIs подавляют диссоциации неактивных белков Ро от ВВП и, следовательно, их взаимодействие с течению эффекторов. GDIs также регулируют Велоспорт GTPases между в цитозоле и мембраны в ячейке. Деятельность GTPases Ро в значительной степени зависит от их движение к клеточной мембраны; Таким образом GDIs рассматриваются в качестве важнейших регуляторов, которые могут поглощать GTPases в цитоплазме через сокрытие их гидрофобные региона/домены11,12.
Для Rho ГТФазы иметь оптимальный сигнализации и функции на всех этапах цикла его активации динамический цикл гидролиза ГТФ загрузки/GTP имеет решающее значение. Любые изменения в этом процессе может привести к последующие изменения в функции клеток, регулируется Rho ГТФазы, таких как клетки полярности, распространения, морфогенез, цитокинез, миграция, адгезии и выживания13,14.
Текущий протокол предоставляет читателям подробный метод для мониторинга малых RhoA ГТФазы активации через расследования их prenylation и ВВП/GTP загрузки. Этот метод также может использоваться для обнаружения prenylation и GTP привязку широкого круга малых GTPases. ГТФазы соединенный assay иммуносорбента может использоваться для измерения уровня активации других видов GTPases, таких как Rac1, Rac2, Rac3, H-, K- или N-РАН, АРФД и Ро-15. СИМВАСТАТИН фармакологических агента используется в качестве примера, как недавно сообщили участвовать в регулировании малого Rho ГТФазы prenylation и активность8,9,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем точный метод измерения малых ГТФазы prenylation и GTP привязки, показанный как малые ГТФазы субцеллюлярные локализации (мембраны против цитозоль) и Ро GTP загрузки. Малые GTPases выражаются в эукариотических клетках и играть существенную роль в пролиферации и моторики, стр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Саид Ghavami было поддержано Грант операционной центра науки здоровья, CHRIM, Грант и исследования Манитоба новый следователь операционной Грант. Джавад Ализаде было поддержано исследований Манитоба студенчества. Шахла Шоджаеи было поддержано здоровье науки фонд действующих грантов и ускорить MITACS докторантура стипендий. Адель Резаи Могадам был поддержан Сенти операционной Грант, который был проведен, Джозеф у. Гордон. Амир а. Zeki было поддержано NIH/NHLBI K08 премии (1K08HL114882-01A1). Марек J. Лос любезно признает поддержку от НКС Грант #2016/21/B/NZ1/02812, поддержке LE STUDIUM института передовых исследований (регион центр-Валь-де-Луар, Франция) через программу Smart Долина Луары общих и совместно финансируется Мари Склодовской-Кюри действия, Грант #665790. Симоне да Силва Роза была поддержана UMGF студенчества.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. 생화학. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The ‘invisible hand’: regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
