Detección de la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio usar membrana fraccionamiento y GTPasa-linked Immunosorbent Assay
Summary
Aquí se describe un protocolo para investigar la Prenilación y guanosina-5′-trifosfato (GTP)-carga de la GTPasa Rho. Este protocolo consta de dos métodos detallados, es decir, ensayo de fraccionamiento de la membrana y un GTPasa-ligado del inmunosorbente. El protocolo puede ser usado para medir la Prenilación y GTP carga de diferentes otras GTPasas pequeñas.
Abstract
La familia de Rho GTPasa pertenece a la superfamilia Ras e incluye a aproximadamente 20 miembros en seres humanos. Rho GTPasas son importantes en la regulación de diversas funciones celulares, incluyendo la dinámica del citoesqueleto, motilidad celular, polaridad celular, Guía axonal, tráfico vesicular y el control del ciclo celular. Cambios en la señalización de la GTPasa Rho juegan un papel regulador esencial en muchas condiciones patológicas, tales como cáncer, enfermedades del sistema nervioso central y sistema inmune-enfermedades. La modificación postraduccional de GTPasas Rho (es decir, Prenilación de mevalonate camino intermedios) y la Unión de GTP son factores clave que afectan a la activación de esta proteína. En este trabajo, se proporcionan dos métodos esenciales y simples para detectar una amplia gama de Rho GTPasa Prenilación y actividades de unión de GTP. Detalles de los procedimientos técnicos que se han utilizado son explicados paso a paso en este manuscrito.
Introduction
Rho GTPasas son un grupo de proteínas pequeñas (21-25 kDa), que bien se conservan a lo largo de la evolución y formar una única subfamilia de la superfamilia Ras de GTPasas pequeñas. En cada subfamilia dentro de esta superfamilia, hay un núcleo de dominio compartido G que participa en la actividad de la GTPasa y de intercambio de nucleótidos1. La diferencia entre la familia de Rho y las otras subfamilias de Ras es la presencia de un “dominio de inserto de Rho” dentro de la 5th β del filamento y el 4th α hélice en la pequeña GTPasa dominio2.
Basado en la clasificación reciente, GTPasas Rho se consideran una familia de proteínas que encajan dentro de la superfamilia de Ras GTPase3de señalización. Mamíferos de Rho de GTPasas tienen 22 miembros basados en su función específica y la caracterización general4 que RhoA, Rac1 y Cdc42 se encuentran entre los miembros más estudiados en este grupo. Rho GTPasas están vinculados a intracelular señalización vías a través de un mecanismo bien regulado que es dependiente de interruptores moleculares vía proteína modificaciones del posttranslational5.
Carga de GTP e hidrólisis son mecanismos esenciales en el ciclo de activación/desactivación de pequeñas GTPasas Rho y están reguladas por proteínas GTPase-que activan (boquetes). Son responsables de la hidrólisis de GTP y trabajar en conjunto con nucleótido intercambio factores de guanina (GEFs) que son responsables de la reacción de carga GTP. Inhibidores de disociación de la PIB de Rho (GDIs) proporcionan más regulación de Rho GTPasas pequeñas vía atar al PIB-limite Rho GTPasas. Esto inhibe la disociación de PIB y facilita el secuestro de pequeñas GTPasas Rho de los sitios de la membrana intracelular activa. Hay también más regulación de proteínas GTPasa Rho con la Prenilación de GDIs que regula la hidrólisis del nucleótido y cambio y los controles PIB/GTP ciclismo1,6,7,8.
GTP-carga y Prenilación de GTPasa Rho participan en el movimiento de la GTPasa Rho entre citosol y membranas de la célula cambiando las propiedades lipofílicas de estas proteínas1,9. Los reguladores antes mencionados interactúan con los fosfolípidos de la membrana celular y otras proteínas modulación del PIB/GTP intercambio actividad10. Por otra parte, GDIs, inhibidores de la disociación, bloquean la hidrólisis de GTP y el intercambio de GTP/PIB. GDIs inhiben la disociación de las proteínas Rho inactivadas de PIB y, por tanto, su interacción con los efectores corriente abajo. GDIs también regulan el ciclo de las GTPasas entre el citosol y la membrana de la célula. La actividad de Rho GTPasas depende en gran medida de su movimiento a la membrana celular; por lo tanto, GDIs son considerados reguladores críticos que pueden secuestrar GTPasas en el citoplasma a través de ocultar su región hidrofóbica/dominios11,12.
Para que Rho GTPasa que una señalización óptima y la función en todas las etapas de su ciclo de activación, el ciclo dinámico de la hidrólisis de GTP-carga/GTP es crucial. Cualquier tipo de alteraciones en este proceso puede resultar en cambios posteriores en las funciones celulares reguladas por Rho GTPasa, como célula polaridad, proliferación, morfogénesis, citocinesis, migración, adherencia y supervivencia13,14.
El protocolo actual proporciona a los lectores con un detallado método para controlar pequeños RhoA GTPase activación a través de la investigación de Prenilación y PIB/GTP de carga. Este método también puede utilizarse para detectar la Prenilación y Unión de GTP de una amplia gama de GTPasas pequeñas. El ensayo de inmunosorción GTPasa puede utilizarse para medir el nivel de activación de otras clases de GTPasas, como Rac1, Rac2, Rac3, H-, K- y N-RAS, Arf y Rho15. La simvastatina agente farmacológico se utiliza como un ejemplo, como se informó recientemente que participan en la regulación de la pequeña GTPasa Rho Prenilación y actividad8,9,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un método preciso para medir la pequeña GTPasa Prenilación y GTP obligatorio muestra pequeña GTPasa localización subcelular (membrana versus citosol) y Rho GTP carga. GTPasas pequeñas se expresan en las células eucariotas y desempeñan un papel esencial en la proliferación celular, la motilidad y estructura. Prenilación y atar GTP están implicados en la regulación de la actividad GTPasa; por lo tanto, los ensayos para evaluar la Prenilación y GTP obligatorio de estas proteínas son …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Saeid Ghavami fue apoyado por una beca salud ciencia centro de funcionamiento, que es CHRIM grant e investigación investigador Manitoba nueva concesión de funcionamiento de funcionamiento. Javad Alizadeh fue apoyado por la beca de investigación de Manitoba. Shahla Shojaei fue apoyado por una beca de Fundación de ciencia de salud funcionamiento y la beca postdoctoral de acelerar el paso. Adel Rezaei Moghadam fue apoyado por un NSERC operación grant que fue sostenida por Joseph W. Gordon. Amir A. Zeki apoyaron el K08 NIH/NHLBI Premio (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los amablemente reconoce el apoyo de NCN #2016/21/B/NZ1/02812, apoyado por LE estudio Instituto de estudios avanzados (región Centre Val de Loire, Francia), a través de su Smart Programa General de Valle de Loira y cofinanciado por el Marie Acciones de Sklodowska-Curie, beca #665790. Simone da Silva Rosa fue apoyada por la beca UMGF.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. 생화학. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The ‘invisible hand’: regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
