Denne protokollen gir leserne å kunne etablere en porcine modell av Segmentinformasjon intestinal iskemi og deretter isolere og kultur intestinal stamceller for studier av epitelial reparasjon etter skade.
Intestinal iskemi er fortsatt en viktig årsak til sykelighet og dødelighet i menneskelig og veterinary pasienter. Mange sykdommer prosesser føre intestinal iskemi, når blodtilførselen og derfor oksygen er redusert til tarmen. Dette fører til intestinal barriere tap og skade på underliggende vev. Intestinal stamceller ligger ved foten av krypten i Lieberkühn og er ansvarlig for intestinal fornyelse homeostase og følgende skade. Ex vivo celle kultur teknikker har tillatt for vellykket studiet av epitelial stamcelleforskningen interaksjoner ved å etablere oppdrettsforholdene som støtter vekst av tredimensjonale epithelial orgel-lignende systemer (kalt “enteroids” og” colonoids”fra små og store tarmen, henholdsvis). Disse enteroids er sammensatt av crypt og villus-lignende domener og modne alle celletyper innen epitel. Historisk har murine modeller vært benyttet for å studere intestinal skade. Men tilbyr en porcine modell flere fordeler som likhet i størrelse samt mage anatomi og fysiologi som mennesker. Ved å benytte en porcine modell, etablere vi en protokoll der Segmentinformasjon ledd av intestinal iskemi kan opprettes i en enkelt dyr, muliggjør studiet av ulik tid poeng iskemiske skader og reparere i vivo. I tillegg beskriver vi en metode for å isolere og kultur intestinal stamceller fra iskemiske løkkene av tarmen, tillater for videre studier av epitelial reparasjon, modulert av stamceller, ex vivo.
Intestinal iskemiske skader, et resultat av nedsatt oksygen tilgjengelighet på grunn av en reduksjon eller fullstendig okklusjon av blodstrømmen til tarmen, forblir en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet i mennesker og dyr pasienter1,2. Iskemiske skader, påfølgende betennelse og cellular infiltrasjon, fører til mucosal barriere kompromiss. Slimhinnene barrieren er avgjørende for forebygging av bakteriell translokasjon og tilknyttede giftstoffer i systemisk sirkulasjon3,4. Etterfølgende reperfusion iskemiske vev kan føre til dannelse av skadelige frie radikaler som kan forverre skade5. Siden intestinal iskemi er sjelden forebygges, har nyeste forskning fokusert på fremmarsj teknikker for tidlig deteksjon av iskemi og utviklingen av romanen behandlingsmetoder som reduserer reperfusion skade eller mål mucosal reparasjon.
Dyremodeller har blitt brukt til å utvide vår grunnleggende vitenskapen kunnskap om ischemia-reperfusion skade og fortsatt avgjørende for translasjonsforskning. Gnager modeller er de mest brukte evne til å være genetisk manipulerte6. Flere nylig imidlertid har bruk av store dyr modeller, spesielt gris, vært orde for fremtidig translational studier av mange fordeler inkludert griser anatomiske og fysiologiske likhetene til mennesker7,8. En rekke skader modeller er utviklet for å studere ischemia-reperfusion skade og fullstendig vaskulær okklusjon, lav-flow iskemi og Segmentinformasjon hvem vaskulær okklusjon. En full gjennomgang av disse modellene er utenfor området for denne artikkelen men forfatterne dirigerer lesere til siste gjennomgang3.
I tillegg til i vivo modeller tilbyr bruk av ex vivo mobilnettet kultur systemer et lovende verktøy for å studere intestinal homeostase og reparasjon etter skade. Intestinal stamceller er ansvarlig for mobilnettet spredning og omsetning av intestinal epithelial fôr. Når isolert fra normal eller skadde tarmen, intestinal stamceller kan opprettholdes i kultur og tjene som et verktøy eller modell stilk cellen og epithelial cellebiologi. Metoder for å isolere og etablere dette tredimensjonale kultur systemer (kalt enteroids og colonoids når avledet fra små og store tarmen, henholdsvis) har blitt beskrevet for en rekke arter og organ systemer9,10 ,11,12,13. Spesielt i mage-tarmkanalen, har disse kultur-systemer blitt brukt til modell gastrointestinal sykdom som kreft, patogen infeksjon og inflammatorisk tarm sykdom14. På denne tiden er det ingen rapporter som beskriver isolasjon og vedlikehold av intestinal stamceller fra ischemically skadet tynntarmen i noen arter. Derfor beskriver her vi prosessen med intestinal iskemi i en roman, store dyr porcine modell som resulterer i reproduserbar skader og muligheten til å isolere intestinal stamceller fra normal og ischemically skadet tarmen for ytterligere studier av utvinning ex vivo.
Utviklingen av en porcine modell av Segmentinformasjon intestinal iskemi utvider på tidligere murine modeller av muliggjør studiet av flere tidspunkt for vev skade innenfor samme dyret. Det er flere kritisk diskusjon rundt denne protokollen inkludert riktig fartøyet hemorroider, vev reperfusion og vellykket krypten cellekultur.
Riktig fartøyet hemorroider er avgjørende for etableringen av en modell av komplett ischemia. Hvis suture er knyttet ujevnt eller klemmen ikke strammet helt, blod fra arteria tykke vegger kan fortsette å angi vevet og kan ikke avsluttes på grunn av sammenbruddet av tynne vegger venen. Dette resulterer i bloduttredelse blod i lamina propria forårsaker ytterligere vevsskade. Imidlertid avhengig av iskemiske skader blir studert, kan fullstendig eller hemoragisk iskemi være ønsket. For eksempel under intestinal transplantasjon, er tarm helt atskilt fra den vascular forsyningen (arterien og venen) i resection fasen av prosedyren, som resulterer i fullstendig intestinal iskemi. Alternativt, men når mesentery er vridd under en hendelse som en intestinal Tarmslyng, venøs retur er ofte hindret først fører til ytterligere blod i vevet før arterial tilførsel blir hindret, dermed skape hemoragisk ischemia.
Iskemiske skader resulterer i skade på vev starter på villus spissen og utvide nedover til bunnen av crypt3. Under iskemi, energi i form av adenosin trifosfat fortsetter å bli brukt og genererer metabolitten hypoxanthine. Når vev er reperfused med oksygen, hypoxanthine blir metaboliseres xantin oksidase og produserer superoxide frie radikaler fører til mucosal skade og attraksjon av vev skade nøytrofile17,18. Arter forskjeller i slimhinnene vaskulær arkitektur samt varierende uttrykk for xantin oksidase, resultere i varierende grad av reperfusion skade3. Feline og gnager modeller av ischemia-reperfusion er mer utsatt for reperfusion skade reaktive oksygen metabolitter19,20. Derimot ble griser funnet for å ha mindre xantin oksidase, og derfor mindre reperfusion skade, noe som gjør denne modellen mer sammenlignbar med den menneskelige tarmen iskemi21. På denne tiden har bruk av knockout eller transgene svin modeller å studere intestinal skade ikke blitt beskrevet, gjør dette en stor begrensning av denne modellen. Valg av riktig dyr modellen avhengig sykdommen prosessen eller bestemt betingelse forskeren ønsker å studere. For eksempel har svin modeller av iskemiske skader opptil 6 h vært beskrevet22, mens mest iskemiske prosedyrer i murine modeller er 45-60 min23.
Vellykket isolering av intestinal Krypter fra normal og ischemically skadet tarmen muliggjør studiet av epitelial utvinning i kultur. Dette systemet lar forskeren fokusere unikt på epitel alene, så det er ikke vascular forsyning eller immun celle komponent å vurdere. Dette gir mulighet til å studere tarmepitelet vekselsvirkningene og gjenoppretting etter skade i tillegg til responsen på ulike vekstfaktorer eller behandlinger administreres under kirurgi eller følgende krypten isolasjon av supplere kultur media. Dette trinnet er den vanskeligste, som isolasjon fra etterlate looper krever forsiktig risting og rask fjerning av EDTA inneholder løsninger i tilfelle crypts har blitt for tidlig avstand. Hvis disse løkkene av tarmen ikke er grundig vasket, har crypts potensial til å bli forurenset i kultur. Som et resultat, lagt antibiotika-antimycotic løsning til begge DR løsninger i tillegg til IESC media. En annen diskusjon point fokuserer på tarmen samlet som en normal kontroll. Som dyrene gjennomgår anestesi med mulige endringer i systemisk vevsperfusjon, sammen med muligheten for sirkulerende inflammatoriske mediatorer sekundært til iskemi, kan med “normale” kontroll vev ikke representere en sann kontroll. I disse eksperimentene er det å merke at kontroll vevet syntes grovt og histologisk sammenlignbare til vev fra dyr som ikke gjennomførte iskemi i andre eksperimenter (Gonzalez, L.M., upubliserte Data, 2017).
I sammendraget beskriver denne metoden en reproduserbar modell av svin intestinal iskemi, som tett modeller hva som skjer i menneskelige iskemiske skader. I tillegg isolering av intestinal stamceller fra iskemiske looper er beskrevet, som tjener til å studere epithelial reparasjon og mulig respons på behandling i kultur.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble støttet av NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 og Institutt for klinisk Sciences formidling midler
Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free | Fisher Scientific | BP-399 | Dilute 1:10 |
Distilled, deionized water (ddH2O) | Used to prepare EDTA and PBS | ||
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Scientific | 20688 | |
Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED45 | Make fresh before each experiment; pH 7.4 |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 646563 | |
Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Gibco | 15240-096 | Anti-Anti solution |
Recombinant human Wnt-3a | R & D Systems | 5036 WN/CF | |
Recombinant human Rspondin1 | R & D Systems | 4645- RS | |
Recombinant human Noggin | R & D Systems | 6057-NG | |
Recombinant human EGF | R & D Systems | 236-EG | |
LY2157299 | SelleckChem | 52230 | |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
Human [leu]15-Gastrin 1 | Sigma Aldrich | G9145 | |
SB202190 | Sigma Aldrich | 57067 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
Water, WFI Quality | Corning, Inc. | 25-055-CM | Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
Matrigel Matrix, GFR | Corning, Inc. | 356231 | Phenol red free |
24 Well Culture Dish | Corning, Inc. | 3524 | |
Conical Tube, 50 ml | Corning, Inc. | 430828 | |
Scalpel Handle | World Precision Instruments | 500236 | |
Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 | World Precision Instruments | 504169 | |
Tissue Forceps | World Precision Instruments | 15918 | |
Debakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501239 | |
Mayo Scissors | World Precision Instruments | 501752 | Curved or straight |
Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments | 501739 | |
Mosquito Forceps, Curved | World Precision Instruments | 503724-12 | Curved or straight (503728-12) |
Hopkins Bulldog Clamp | Stoelting Co. | 52120-40P | Straight |
Silk, 2-0 | Henry Schein | 685S-BUT | Any similar brand is acceptable |
Towel Clamps | World Precision Instruments | 501700 | |
Needle Holder | World Precision Instruments | V503382 | |
Wire suture, 20 gauge | Henry Schein | 19075 | Cut and straighten before use. |
Surgical Towels | Henry Schein | ST1833 | Any similar product is acceptable. |
Lactated Ringers Solution | Henry Schein | 9851 | |
Chlorhex antiseptic scrub (4%) | Henry Schein | VINV-CHMX-SCRB | Any similar brand is acceptable |
Isopropyl Alcohol 70% | Henry Schein | MS071HS | Any similar brand is acceptable |
IV catheter, 22 gauge | Henry Schein | 2225PUR | May need 20g or 24 g depending on size of the vein |
Xylazine (100 mg/ml) | Henry Schein | 33198 | |
Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 11695-6835-1 | Controlled medication |
Isoflurane solution | Henry Schein | 10015516 | |
Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) | Vortech Pharm. | Multiple brands of Pentobarbital Sodium available. | |
Heating pad | Gaymar | Tpump Core Warming System; others are available. | |
Mindray Datascope Monitor | Mindray North America | Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable | |
Vaporizer | Vetland Medical | Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available. | |
Fluid Pump | Abbott Hospira | Plum A+; Any similar manufacturer is recommended. |