Detta protokoll kan läsarna att framgångsrikt etablera en svin modell av segmentell intestinal ischemi och därefter isolera och kultur intestinal stamceller för studien av epitelial reparation efter skada.
Intestinal ischemi förblir en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet och veterinärmedicinska patienter. Många sjukdomsprocesser resultera i intestinal ischemi, när blodtillförseln och därför syre minskas till tarmen. Detta leder till tarmbarriären förlust och skador i underliggande vävnad. Intestinal stamceller uppehålla sig vid basen av kryptor av Lieberkühn och ansvarar för intestinal förnyelse under homeostas och följande skada. Ex vivo cell kultur tekniker har tillåtit för framgångsrika studier av epitelial stamceller interaktioner genom att upprätta odlingsbetingelser som stöder tillväxten av tredimensionella epiteliala organ-liknande system (kallas ”enteroids” och ” colonoids ”från små och stora inälvan, respektive). Dessa enteroids är sammansatt av kryptan och villus-liknande domäner och mogna för att innehålla alla de celltyper som finns inom epitel. Murina modeller har historiskt använts för att studera intestinal skada. Men erbjuder en svin modell flera fördelar inklusive likheten mellan storlek samt gastrointestinala anatomi och fysiologi som människor. Genom att utnyttja en svin modell, upprätta vi ett protokoll där segmentell slingor av intestinal ischemi kan skapas inom ett enda djur, gör det möjligt att studera olika tidpunkter av ischemisk skada och reparera i vivo. Dessutom beskriver vi en metod för att isolera och kultur de intestinala stamcellerna från ischemisk slingor av tarmen, vilket möjliggör fortsatt studiet av epitelial reparation, moduleras av stamceller, ex vivo.
Intestinal ischemisk skada, till följd av minskad syre tillgänglighet på grund av en minskning eller komplett ocklusion av blodflödet till tarmen, är fortfarande en betydande orsak till sjuklighet och dödlighet i människors och djurs patienter1,2. Ischemisk skada, tillsammans med efterföljande inflammation och cellulär infiltration, leder till slemhinnor barriär kompromiss. Slemhinnor barriären är kritisk till att förebygga bakteriell translokation och associerade gifter i den systemiska cirkulation3,4. Efterföljande reperfusion av ischemisk vävnad kan resultera i bildandet av skadliga reaktiva syreradikaler som kan förvärra skadan5. Eftersom intestinal ischemi är sällan förebyggas, har mest aktuella forskning fokuserat på att vidareutveckla metoder för tidig upptäckt av ischemi och utvecklingen av nya terapeutiska metoder som minskar reperfusion skada eller målet slemhinnor reparation.
Djurmodeller har använts i stor utsträckning att expandera vår grundläggande vetenskap kunskap om ischemi-reperfusionsskada och förbli imperativ för translationell forskning. Djurmodeller har varit den mest använda på grund av deras förmåga att vara genetiskt manipulerade6. Mer nyligen dock har användningen av stora djurmodeller, särskilt gris, förespråkats för framtida translationella studier på grund av ett antal fördelar inklusive svin anatomiska och fysiologiska likheter människor7,8. En mängd skada modeller har utvecklats för att studera ischemi-reperfusionsskada och inkluderar komplett vaskulär ocklusion, lågt flöde ischemi och segmentell mesenterica vaskulär ocklusion. En fullständig översyn av dessa modeller är utanför sfären av denna artikel men författarna direkt läsare till en nyligen granskning3.
Förutom i vivo modeller erbjuder ex vivo cellulära kultur system ett lovande verktyg för att studera intestinal homeostas och reparation efter skada. Intestinal stamceller ansvarar för cellulär proliferation och omsättning av intestinal epitel slemhinnan. När isolerade från normal eller skadade tarmen, intestinal stamceller kan upprätthållas i kultur och fungera som ett verktyg eller en modell för att studera stamceller och epitelial cellbiologi. Metoder att isolera och fastställa dessa tredimensionella kultur system (som kallas enteroids och colonoids när härrör från små och stora inälvan, respektive) har beskrivits för en mängd arter och orgel system9,10 ,11,12,13. Specifikt inom magtarmkanalen, har dessa kultur-system använts till modell gastrointestinal sjukdom inklusive cancer, patogen infektion och inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom14. Vid denna tid finns det inga rapporter som beskriver isolering och underhåll av intestinal stamceller från ischemically skadade tunntarmen i alla arter. Därför, här beskriver vi processen för intestinal ischemi i en roman, stora svin djurmodell vilket ger reproducerbara skada och förmågan att isolera intestinal stamceller från normala och ischemically skadade tarmen för ytterligare studier av återhämtning för ex vivo.
Utvecklingen av en svin modell av segmentell intestinal ischemi expanderar vid tidigare murina modeller genom att tillåta för studier av flera tidpunkter av vävnadsskada inom samma djur. I området i närheten finns det flera kritiska diskussionspunkter i detta protokoll inklusive korrekt fartyget ligatur, vävnad reperfusion och framgångsrika crypt cellodling.
Ordentlig fartyget ligatur är avgörande för skapandet av en modell av komplett ischemi. Om suturen är knuten ojämnt eller klämman inte dras åt helt, blod från den tjocka artären kan fortsätta att ange vävnaden och kan inte avsluta på grund av kollapsen av tunnväggiga venen. Detta resulterar i extravasering av blod i lamina propria orsakar ytterligare vävnadsskada. Dock beroende på vilken typ av ischemisk skada som studeras, kan komplett eller hemorragisk ischemi önska. Till exempel håller på tarmtransplantation avskiljs tarmen fullständigt från vaskulära leverans (artär och ven) under fasen resektion av förfarandet, vilket resulterar i fullständig intestinal ischemi. Alternativt, dock när krös är vriden under ett evenemang såsom en intestinal tarmvred, den venöst återflöde ofta blockeras först, leder till ytterligare blod inom vävnaden innan arteriell försörjning hindras, vilket skapar hemorragisk ischemi.
Ischemisk skada leder till vävnadsskada börjar på villus spetsen och sträcker sig ner till basen av crypt3. Under ischemi, energi i form av adenosintrifosfat fortsätter att användas och genererar den metabolit hypoxantin. När vävnaden är reperfused med syre, hypoxantin blir metaboliseras av xantin oxidas och producerar superoxid fria radikaler leder till slemhinnor skada och attraktion av vävnad skada neutrofiler17,18. Arter skillnader i slemhinnor vaskulära arkitektur samt varierande uttryck av xantin oxidas, leda till olika grader av reperfusion skada3. Feline och gnagare modeller av ischemi-reperfusion är mer mottagliga för reperfusionsskada från reaktivt syre metaboliter19,20. Däremot befanns svin har mindre xantin-oxidas och därför mindre reperfusionsskada, vilket gör denna modell mer jämförbar med human intestinal ischemi21. Vid denna tid, har användning av knockout eller transgena svin modeller att studera intestinal skada inte beskrivits, vilket gör detta till en stor begränsning av denna modell. Val av rätt djur modell beror på sjukdomen som är processaa eller grundförutsättningen forskaren vill studera. Exempelvis varit svin modeller av ischemisk skada upp till 6 h beskrivs22, mest ischemisk förfaranden i murina modeller är 45-60 min23.
Framgångsrika isolering av intestinal kryptor från normala och ischemically skadat tarmen möjliggör studiet av epitelial återhämtning i kultur. Detta system tillåter forskare att fokusera unikt på epitelet ensam, eftersom det inte kärlen eller immunceller komponent att överväga. Detta ger möjlighet att studera epitelial cell interaktioner och återhämtning efter skada förutom att bemöta olika tillväxtfaktorer, eller behandling under kirurgi eller följande crypt isolering genom att komplettera kultur media. Detta steg återstår den svåraste, eftersom isolering från allvarligt skadad looparna kräver milda skakningar och snabb borttagning av EDTA-innehållande lösningar om kryptor har blivit förtidigt dissocierade. Om dessa slingor av tarmen inte tvättas grundligt, har kryptor potential att bli smittade på kultur. Som ett resultat, lades antibiotika-antimycotic lösning till både DR lösningar utöver IESC media. En annan diskussionsfråga fokuserar på tarmen samlas in som en normal kontroll. Som djuren genomgå anestesi med möjliga förändringar i systemisk vävnadsperfusion, tillsammans med möjligheten av cirkulerande inflammatoriska mediatorer sekundärt till ischemi, får även ”normala” kontroll vävnad inte representera en sann kontroll. I dessa experiment är det att notera att kontroll vävnaden verkade grovt och histologiskt jämförbar med vävnad från djur som inte genomgick ischemi i andra experiment (Gonzalez, L.M., opublicerade Data, 2017).
Sammanfattningsvis beskriver denna metod en reproducerbar modell av svin intestinal ischemi, som noga modeller vad som sker i människors ischemisk skada. Dessutom beskrivs isolering av intestinal stamceller från ischemisk loopar, som tjänar till att studera epitelial reparation och möjliga svar på behandling av kultur.
The authors have nothing to disclose.
Projektet stöddes av NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 och inst. för kliniska vetenskaper spridning medel
Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free | Fisher Scientific | BP-399 | Dilute 1:10 |
Distilled, deionized water (ddH2O) | Used to prepare EDTA and PBS | ||
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Scientific | 20688 | |
Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED45 | Make fresh before each experiment; pH 7.4 |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 646563 | |
Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Gibco | 15240-096 | Anti-Anti solution |
Recombinant human Wnt-3a | R & D Systems | 5036 WN/CF | |
Recombinant human Rspondin1 | R & D Systems | 4645- RS | |
Recombinant human Noggin | R & D Systems | 6057-NG | |
Recombinant human EGF | R & D Systems | 236-EG | |
LY2157299 | SelleckChem | 52230 | |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
Human [leu]15-Gastrin 1 | Sigma Aldrich | G9145 | |
SB202190 | Sigma Aldrich | 57067 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
Water, WFI Quality | Corning, Inc. | 25-055-CM | Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
Matrigel Matrix, GFR | Corning, Inc. | 356231 | Phenol red free |
24 Well Culture Dish | Corning, Inc. | 3524 | |
Conical Tube, 50 ml | Corning, Inc. | 430828 | |
Scalpel Handle | World Precision Instruments | 500236 | |
Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 | World Precision Instruments | 504169 | |
Tissue Forceps | World Precision Instruments | 15918 | |
Debakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501239 | |
Mayo Scissors | World Precision Instruments | 501752 | Curved or straight |
Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments | 501739 | |
Mosquito Forceps, Curved | World Precision Instruments | 503724-12 | Curved or straight (503728-12) |
Hopkins Bulldog Clamp | Stoelting Co. | 52120-40P | Straight |
Silk, 2-0 | Henry Schein | 685S-BUT | Any similar brand is acceptable |
Towel Clamps | World Precision Instruments | 501700 | |
Needle Holder | World Precision Instruments | V503382 | |
Wire suture, 20 gauge | Henry Schein | 19075 | Cut and straighten before use. |
Surgical Towels | Henry Schein | ST1833 | Any similar product is acceptable. |
Lactated Ringers Solution | Henry Schein | 9851 | |
Chlorhex antiseptic scrub (4%) | Henry Schein | VINV-CHMX-SCRB | Any similar brand is acceptable |
Isopropyl Alcohol 70% | Henry Schein | MS071HS | Any similar brand is acceptable |
IV catheter, 22 gauge | Henry Schein | 2225PUR | May need 20g or 24 g depending on size of the vein |
Xylazine (100 mg/ml) | Henry Schein | 33198 | |
Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 11695-6835-1 | Controlled medication |
Isoflurane solution | Henry Schein | 10015516 | |
Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) | Vortech Pharm. | Multiple brands of Pentobarbital Sodium available. | |
Heating pad | Gaymar | Tpump Core Warming System; others are available. | |
Mindray Datascope Monitor | Mindray North America | Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable | |
Vaporizer | Vetland Medical | Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available. | |
Fluid Pump | Abbott Hospira | Plum A+; Any similar manufacturer is recommended. |