Mikroglia er hjernen immunceller, der undersøgelse og reagere på ændrede hjernens fysiologi gennem morfologiske ændringer, som kan vurderes kvantitativt. Denne protokol beskriver en ImageJ baseret analyse protokol til at repræsentere mikroglia morfologi som løbende data ifølge målinger som celle forgrening, kompleksitet og form.
Mikroglia er hjernen fagocytter, der deltager i hjernen homøostase og løbende undersøge deres miljø for dysfunktion, skade og sygdom. Som de første respondere, mikroglia har vigtige funktioner til at afbøde neuron og glia dysfunktion, og i denne proces, de gennemgår en bred vifte af morfologiske ændringer. Mikroglia morfologier kan kategoriseres deskriptiv, eller alternativt kan kvantificeres som en kontinuerlig variabel til parametre som celle forgrening, kompleksitet og form. Mens metoder til kvantificering mikroglia anvendes til enkelt celler, gælde få teknikker flere mikroglia i en hele photomicrograph. Formålet med denne metode er at kvantificere flere og enkelt celler ved hjælp af let tilgængelige ImageJ protokoller. Denne protokol er en oversigt over trinene og ImageJ plugins anbefales at konvertere fluorescens og lysfelt mikrofotografier til repræsentative binære og skeletteret billeder og til at analysere dem ved hjælp af software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) og FracLac for morfologi dataindsamling. Output af disse plugins opsummere celle morfologi proces slutpunkter, vejkryds, og længde samt kompleksitet, celle form og størrelse deskriptorer. Skelet analyse protokollen beskrevet heri er velegnet til en regional analyse af flere mikroglia i en hele photomicrograph eller en region af interesse (ROI), der henviser til, at FracLac giver en supplerende individuelle celle analyse. Kombineret, giver protokollen et mål, følsomme, og omfattende vurderingsværktøj, der kan bruges til at stratificere mellem forskellige mikroglia morfologier stede i raske og skadede hjernen.
Mikroglia har en umiddelbar og forskelligartede morfologiske reaktion på ændringer i hjernens fysiologi1 langs et kontinuum af muligheder der spænder fra hyper-forgrening og meget komplekse morfologier til de-forgrenet og amoeboid morfologier2 . Mikroglia kan også blive polariseret og stang-formede3. Mikroglia celle forgrening defineres almindeligvis som en kompleks figur har flere processer og er ofte rapporteret som antallet slutpunkter pr. celle og længden af celle processer. Da mikroglia er fintunet til neuronal og glial funktion gennem kontinuerlig celle-celle cross-talk og i vivo motilitet4,5, kan mikroglia morfologier tjene som indikatorer for forskellige cellefunktioner og dysfunktioner i hjernen. En kvantitativ tilgang er nødvendigt at tilstrækkeligt beskriver mangfoldigheden af disse morfologiske ændringer og at skelne mellem forskelle blandt forgrenet celler, der opstår med subtile fysiologiske forstyrrelser (f.eks. epilepsi5,6 og hjernerystelse7) ud over brutto skade (såsom slagtilfælde8). Øget brug af morfologi kvantificering7,8,9,10,11,12,13,14 vil afsløre den fulde mangfoldighed af mikroglia morfologier under sundhed og sygdom. De nuværende undersøgelse detaljer trinvis brugen af ImageJ plugins nødvendigt at opsummere mikroglia morfologi fra fluorescerende eller ikke-fluorescerende mikrofotografier af mikroglia erhvervet i faste gnaver væv efter Immunhistokemi (IHC).
Central til analyseteknikker beskrevet her er de ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, udviklet i 2010 at kvantificere store brystkirtler strukturer, og FracLac16, udviklet i 2014 at integrere ImageJ og fraktal analyse til kvantificere individuelle mikroglia figurer. Disse plugins giver en hurtig analyse af mikroglia forgrening inden for hele mikrofotografier eller flere mikroglia af en defineret ROI indenfor en photomicrograph. Denne analyse kan bruges alene eller supplere med fraktale analyse. Encellede fraktal analyse (FracLac) kræver en investering af tid, men giver flere morfologi udgange vedrørende mikroglia kompleksitet, form og størrelse. Brugen af begge værktøjer er ikke overflødige, som cellen forgrening er et supplement til celle kompleksitet, og kombinationen af flere parametre kan bruges til at skelne mellem forskellige mikroglia morfologier inden for datasæt12,17.
Mikroglia celler er fintunet til fysiologi og patologi inden for deres mikro-domæner og vise en bred vifte af morfologier2 i både subtile7,14 og grov skade8. Brugen af ImageJ protokoller gør mikroglia morfologi kvantificering tilgængelige for alle laboratorier som platform og plugins er en open source billedbehandling software. Mens den beskrevne protokol er fokuseret på billedbehandling og analyse ved hjælp af denne software, begynder konsistens dataindsamling, validitet og pålidelighed med fremragende IHC og mikroskopi. Denne protokol bruges til at forbedre binær, skelet og kontur repræsentationer af hele mikrofotografier og enkelt celler men kan ikke træde i stedet for fattige IHC farvning og mikroskopi, der resulterer i lav kontrast, sløret eller forvrænget billeder. Som en ekstra overvejelse, skal der udvises forsigtighed ikke at flade hjernevæv under opbevaring, før skæring, som uigenkaldeligt ændrer mikroglia morfologi. Endelig, inden for hvert eksperiment mikroglia skal være afbildet ved hjælp af den samme skala som den samme mikroskop. Instrumentering, mål og software varierer blandt mikroskoper, som vil resultere i forskellige størrelse mikrofotografier trods lignende mål og ændre detaljer samt antallet af celler i hver ramme. For eksempel, resulterer billede erhvervelse ved hjælp af en 40 X mål på en Leica SPII i to gange antallet af celler og mindre detaljeret end erhvervelse ved hjælp af en Zeiss 880. Dette er især vigtigt for celle forgrening data indsamlet fra hele rammen i stedet for en enkelt celle, som det bliver et spørgsmål om data prøveudtagning.
Generelt forud skelet analyse, som udnytter den hele photomicrograph enkelt celle fraktal analyse af to grunde. Afgørende celle forgrening af alle celler i en photomicrograph er hurtig, når sammenlignet med enkelt celle fraktal analyse og kan betragtes som en screeningsværktøj, hvis tid er en faktor. Derudover bruges binære billederne stammer under skelet analyse for fraktal analyse. Når afbildet, er der en række kritiske trin, der kan påvirke skelet analyseresultater og indføre bruger-indflydelse. Protokollen trinnene er de fleste variabel mellem brugere er trin 4.2 (øge billedets lysstyrke) og trin 4.5 (fastsættelse af tærsklen). Hvor det er muligt, er en optimal antallet at øge lysstyrken (maks eller min skyderen mellem 0-255) bestemmes og holdt konstant for alle billeder og brugere. Hvor billedet variation er stor, kan brugeren i stedet vælge en lysstyrke, som vil variere mellem billeder. Alternativt, hvis billeder er lyse og kontrast er høj, derefter øge lysstyrken kan udelades og tærskel kan være standardiseret ved hjælp af et speciale tærskel filter (fx., Huang) snarere end den mere variabel standard. Når optimeret, skal parametrene, der overholdes for at minimere yderligere brugerindflydelse.
Et eksempel på bruger variabilitet er præsenteret i figur 5. Dataværdier blev øget i bruger 1 og bruger 2 og derfor variabilitet ville øges, hvis bruger 1 og bruger 2 bidraget til dataindsamlingen. Et eksempel på forskellene i bruger 1 og bruger 2 binære og skeletteret billeder er fremhævet af farvede cirkler (figur 5). I dette tilfælde var begge brugere kortvarigt uddannet bachelor studerende med begrænset ekspertise i mikroglia. Regelmæssige tilsyn og mentorordninger af en ekspert samt øget protokol undervisning2 mikroglia kan reducere Inter bruger variabilitet. Selv om ikke vurderes her, er fraktal analyse mindre Inter bruger variabilitet, fordi binær cellerne manuelt og individuelt isoleret fra en photomicrograph i stedet for at stole udelukkende på tærskel til at bestemme mikroglia figurer. Men alle metoder besidder nogle variation mellem brugere. Derfor, en enkelt bruger (ideelt, trænet af nogle ekspertise i mikroglia celler) bør færdiggøre dataindsamling for en hele datasættet.
Yderligere ændringer kan gøres nemt i denne protokol og afhænger af billedkvaliteten, og bestræbelserne på taget for at reducere støj og sikre proces connectivity. For eksempel, hvis kontrast er tilstrækkelig, derefter Uskarp maske er ikke nødvendig og kan udelades. Det er fornuftigt at optimere og færdiggøre protokollen for et bestemt sæt af billeder, både eksperimentel tilfælde og kontrol, før indsamling af data fra en hele sæt. Endelig, yderligere plugins kan bruges i stedet for andre at afklare eller skærpe billeder, der ikke var beskrevet i denne protokol som spile eller skærpe.
Fordelene ved denne protokol er dens universel tilgængelighed og tilpasningsevne. Derudover er vurderer celle forgrening ved hjælp af AnalyzeSkeleton hurtig og gælder for en hel photomicrograph. En fordel ved multi celle analyse tilgang er fokus på en hel region i stedet for enkelte celler. Det er derfor muligt at hurtigt at vurdere den gennemsnitlige forgrening (i form af slutpunkter og proces længde) af alle mikroglia inden for billedet. Skelet analyse giver en analyse af flere celler: en data prøveudtagning i celle tal, der ikke kan matches af fraktal analyse på grund af den krævede tid investering at isolere enkelt celler fra mikrofotografier. En forekomst, hvor dette måtte være bedst egnet ville være i screening mikroglia morfologier i nærliggende til en fokal skade. En begrænsning er hele feltet image rendering at skabe skelet modeller af IHC mikrofotografier er ufuldstændig i forhold til den mere tidskrævende enkelt celle tilgang. Derudover en region analyse er ikke afpasset omstændighederne hvor mikroglia morfologier er drastisk anderledes inden for det samme felt. Endelig er denne analysemetode, der afhængige af celletal, en parameter, der kan variere mellem forsøgsbetingelser.
Fraktal analyse er udført på en enkelt celle og derfor supplerer den gennemsnitlige celle forgrening data output som følge af den skelet analyse. Selvom meget mere tid forbruge, denne investering giver en bred vifte af morfometrisk data. For eksempel celle tæthed, span ratio, og cirkularitet data beskrive størrelse, strækforlængelse og form af den celle kontur, henholdsvis. Fraktal dimension og lacunarity opsummere celle kompleksitet og figur heterogenitet, henholdsvis. En mere dybtgående Resumé af hvordan hver parameter er udregnet og hvordan data kan fortolkes er fastsat i den interaktive manuel16 og sådanne detaljer bør overvejes i forbindelse med den konkrete problemformulering. Den beskrevne protokol resulterer i følsomme værktøjer til at kvantificere små ændringer i 2D mikroglia morfologier, der kan opstå i fysiologiske og patologiske betingelser. Yderligere morfometrisk analyse som soliditet, Konveksitet og form faktor16,20 kan være muligt, hvis generering af 3D-figurer.
Protokollen udvikling og tilpasning er kontinuerlig og brugerdreven. Det er blevet udvidet fra fluorescens8 DAB/lyse-feltet billeder7 men ikke endnu paraffin indlejrede væv. Det tillæg, det kan bruges sammen med proprietære software som Imaris for yderligere analyse. Denne protokol kan anvendes til en bred vifte af fysiologi og er ikke begrænset til mikroglia men kan anvendes til celler eller væv med bestemt mønstre eller figurer, der kan identificeres ved hjælp af IHC metoder. Endelig, med tilstrækkelig stikprøvestørrelse, en flerdimensional eller cluster analyse kan anvendes til at stratificere mikroglia ifølge morfologi12,21; Dette er meningsfulde oplysninger som mikroglia morfologi er en vigtig indikator for mikroglia funktioner og svar hen til deres omgivelser. Påskønnelse for microglial morfologiske diversitet er voksende og vigtigt at fuldt ud forstå neuron-glia-vaskulære interaktioner under sundhed og sygdom. Vækst i feltet forstærkes af veludviklede, nem at bruge og reproducerbar protokoller til at kvantificere og opsummere mikroglia morfologi ved hjælp af flere løbende variabler.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse modtog økonomisk støtte fra NINR (F32NR013611). Vi ønsker at anerkende og takke udviklere af AnalyzeSkeleton(2D/3D) og FracLac (Arganda Carreras et al. og Karperien et al., henholdsvis) uden som analysen beskrevet heri vil ikke være muligt.
primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |