Mikroglia är hjärnan immunceller som undersökning och reagera på förändrad hjärnans fysiologi genom morfologiska förändringar som kan utvärderas kvantitativt. Denna protokollet beskrivs en ImageJ baserat analys protokoll att representera mikroglia morfologi som kontinuerlig data enligt statistikföretaget såsom cell förgrening, komplexitet och form.
Mikroglia är hjärnan fagocyter som deltar i hjärnan homeostas och kontinuerligt kartlägga deras miljö för dysfunktion, skada och sjukdom. Som de första responders, mikroglia har viktiga funktioner att mildra neuron och glia dysfunktion och i denna process, de genomgår en rad morfologiska förändringar. Mikroglia morfologier kan kategoriseras beskrivande eller, alternativt, kan kvantifieras som en kontinuerlig variabel för parametrar såsom cell förgrening, komplexitet och form. Samtidigt metoder för kvantifiering av mikroglia tillämpas på enstaka celler, tillämpas några tekniker på flera mikroglia i en hela photomicrograph. Syftet med denna metod är att kvantifiera multipel och enstaka celler med hjälp av lättillgängliga ImageJ protokoll. Detta protokoll är en sammanfattning av stegen och ImageJ plugins rekommenderas att konvertera fluorescens och ljusa fält mikrofotografier till representativa binära och skeletterad bilder och analysera dem med hjälp av programvara plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) och FracLac för morfologi datainsamling. Resultaten av dessa plugins sammanfatta cellmorfologi när det gäller processen slutpunkter, korsningar, och längd samt komplexitet, cell form och storlek deskriptorer. Protokollet skelett analys beskrivs häri är väl lämpad för en regional analys av flera mikroglia i en hela photomicrograph eller område av intresse (ROI) medan FracLac ger en kompletterande enskild cell analys. Protokollet i kombination, och ger en objektiv, känslig och omfattande bedömningsverktyg som kan användas för att stratifiera mellan olika mikroglia morfologier finns i friska och skadade hjärnan.
Mikroglia har ett omedelbart och olika morphologic svar till förändringar i hjärnans fysiologi1 längs ett kontinuum av möjligheter som spänner från hyper-förgrening och mycket komplex morfologier till de förgrenat och amoeboid morfologier2 . Mikroglia kan också bli polariserade och stavformade3. Mikroglia cell förgrening definieras brukar som en komplex form med flera processer och rapporteras ofta som antalet slutpunkter per cell och längden på cellprocesser. Eftersom mikroglia är fint stämda till neuronala och gliaceller funktion genom kontinuerlig cell-cell överhörning och i vivo motilitet4,5, kan mikroglia morfologier fungera som indikatorer på olika cellfunktioner och dysfunktioner i hjärnan. En kvantitativ metod är nödvändigt att beskriva mångfalden av dessa morphologic ändringar och att urskilja skillnader bland förgrenat celler som uppstår med subtila fysiologiska störningar (t.ex. epilepsi5,6 och hjärnskakning7) förutom grov skada (t.ex. stroke8). En ökad användning av morfologi kvantifiering7,8,9,10,11,12,13,14 kommer att avslöja hela mångfalden av mikroglia morfologier under hälsa och sjukdom. Nuvarande studera Detaljer stegvis användning av ImageJ plugins nödvändigt att sammanfatta mikroglia morfologi från fluorescerande eller icke-fluorescerande mikrofotografier av mikroglia förvärvat i fasta gnagare vävnad efter immunhistokemi (IHC).
Centralt att de analysmetoder som beskrivs här är ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, utvecklat i 2010 att kvantifiera stora bröst strukturer, och FracLac16, utvecklat under 2014 att integrera ImageJ och fractal analys till kvantifiera enskilda mikroglia former. Dessa plugins ger en snabb analys av mikroglia förgrening inom hela mikrofotografier eller flera mikroglia av en definierad ROI inom en photomicrograph. Denna analys kan användas ensamt eller i komplement med fractal analys. Den encelliga fractal analysen (FracLac) kräver en investering av tid men ger flera morfologi utgångar angående mikroglia komplexitet, form och storlek. Användning av båda verktygen är inte överflödig, som cell förgrening är komplement till cell komplexitet och en kombination av flera parametrar kan användas för att skilja mellan olika mikroglia morfologier inom datamängder12,17.
Mikroglia celler är fint stämda till fysiologi och patologi inom sina mikro-domäner och visa en rad olika morfologier2 i både subtila7,14 och grov skada8. Användning av ImageJ protokoll gör mikroglia morfologi kvantifiering tillgänglig för alla laboratorier som plattform och plugins är ett bildbehandlingsprogram för öppen källkod. Protokollet beskrivs är fokuserat på bildbehandling och analys med hjälp av denna programvara, börjar konsekvens av datainsamling, giltighet och tillförlitlighet med utmärkta IHC och mikroskopi. Detta protokoll används för att förbättra binär, skelett och disposition representationer av hela mikrofotografier och enstaka celler men inte kan ta platsen för fattiga IHC färgning och mikroskopi som resulterar i låg kontrast, suddig eller förvrängd bilder. Som en ytterligare övervägande, måste försiktighet iakttas inte att platta hjärnvävnaden under lagring, innan snittning, som oåterkalleligen ändrar mikroglia morfologi. Slutligen, inom varje experiment, mikroglia måste avbildas med samma skala samt samma mikroskopet. Instrumentering, mål och programvara varierar bland Mikroskop vilket kommer att resultera i olika storlek mikrofotografier trots liknande mål och ändra detaljerna liksom antalet celler i varje ram. Till exempel resulterar bild förvärv med ett 40 X-objektiv på en Leica SPII i två gånger antalet celler och mindre detaljer än förvärv med en Zeiss 880. Detta är särskilt viktigt för cell förgrening insamlade från hela bildrutan i stället för en enda cell, som detta blir en fråga om data provtagning.
I allmänhet föregår skelett analys som utnyttjar den hela photomicrograph enda cell fractal analysen av två skäl. Avgörande cell förgrening av alla celler i en photomicrograph är snabb när jämfört med enstaka cell fractal analysen och kan betraktas som en screeningmetod om tid är en faktor. Dessutom används de binära bilder härrör under skelett analys för fractal analys. När avbildas, finns det ett antal kritiska steg som kan påverka skelett analysresultat och införa brukarinflytande. Protokollstegen som är mest variabla mellan användare är steg 4,2 (öka bildens ljusstyrka) och steg 4,5 (fastställandet av tröskelvärdet). Om möjligt, en optimal nummer att öka ljusstyrka (max eller min skjutreglaget mellan 0-255) bestäms och hölls konstant för alla bilder och användare. Där bilden variationen är stor, kan användaren i stället välja en ljusstyrka som varierar mellan bilderna. Alternativt, om bilder är ljusa och kontrasten är hög, då ökande ljusstyrka kan utelämnas och tröskelvärde kan normaliseras med hjälp av en specialitet tröskel filter (t.ex., Huang) snarare än mer varierande standard. När optimerad, bör parametrar följas för att minimera ytterligare användare-påverkan.
Ett exempel på användaren variabilitet presenteras i figur 5. Datavärden höjdes i användare 1 kontra användare 2 och därför variabilitet skulle höjas om både användare 1 och användare 2 bidragit till datainsamling. Ett exempel på skillnader i användare 1 och användare 2 binära och skeletterad bilder är markerade med färgade cirklar (figur 5). I detta fall var båda användarna kort utbildade studenter med begränsade sakkunskapen i mikroglia. Regelbunden tillsyn och mentorskap av en mikroglia expert tillsammans med ökad protokoll utbildning2 kan minska mellan användaren variabilitet. Men inte bedömas här, är fraktal analys mindre föremål mellan användaren variabilitet eftersom binära celler är manuellt och individuellt isolerade från en photomicrograph i stället för att enbart förlita sig på tröskelvärde att bestämma mikroglia former. Dock äger alla metoder vissa variationer mellan användare. Därför, en enskild användare (idealiskt, utbildad av viss expertis inom mikroglia celler) bör slutföra datainsamlingen för en hela datamängden.
Ytterligare ändringar kan göras enkelt till detta protokoll och beror på bildkvalitet och de ansträngningar som vidtagits för att minska buller och säkerställa processen anslutning. Till exempel om kontrasten är adekvat, sedan oskarp mask är inte nödvändigt och kan utelämnas. Det är klokt att optimera och slutföra protokollet för en specifik uppsättning bilder, både experimentella fall och kontroller, före datainsamling från en hel uppsättning. Slutligen, ytterligare plugins kan användas i stället för andra att förtydliga eller skärpa bilder som inte beskrivs i detta protokoll såsom vidgas eller slipa.
Fördelarna med detta protokoll är dess universella tillgänglighet och anpassningsförmåga. Bedömningen av cell förgrening med AnalyzeSkeleton är dessutom snabb och gäller för en hela photomicrograph. En fördel med mång–cell analys strategi är fokus på en hel region i stället för enstaka celler. Därför är det möjligt att snabbt bedöma den genomsnittliga förgrening (avseende endpoints och processen längd) av alla mikroglia i bilden. Skelett-analysen ger en analys av flera celler: en datasampling när det gäller cell nummer som inte kan matchas av fraktal analys på grund av tid som krävs investeringar att isolera enstaka celler från mikrofotografier. En instans där detta kan vara bäst vore screening mikroglia morfologier i anslutning till en fokal skada. En begränsning är den hela fältet bildåtergivning skapa skelett modeller av IHC mikrofotografier är ofullkomlig jämfört med metoden mer tidskrävande enda cell. Dessutom är en regionen analys inte lämpligt till omständigheter där mikroglia morfologier är drastiskt olika inom samma område. Slutligen, denna analysmetod är beroende av celltal, en parameter som kan skilja sig mellan experimentella förhållanden.
Fraktal analys utförs på en enda cell och därför kompletterar den genomsnittliga cell förgrening utdata från skelett analysen. Även om mycket mer tidsödande, denna investering ger en behaglig morfometriska data. Till exempel cell densiteten, span förhållande, och loopkontroll data beskriva storleken, töjning och formen på cell dispositionen, respektive. Fraktala dimensionen och lacunarity sammanfatta cell komplexitet och form heterogenitet, respektive. En mer djupgående Sammanfattning av hur varje parameter beräknas och hur data kan tolkas finns i interaktiva manuell16 och sådan detalj övervägas i förhållande till den specifika frågeställningen. Protokollet beskrivs resulterar i känsliga verktyg att kvantifiera små förändringar i 2D mikroglia morfologier som kan uppstå i fysiologiska och patologiska förhållanden. Ytterligare morfometriska analys som Soliditet, konvexitet och form faktorn16,20 kan vara möjligt om genererar 3D-former.
Protokoll utveckling och anpassning är kontinuerlig och användardriven. Det har utvidgats från fluorescens8 till DAB/ljusa-fältet bilder7 men ännu inte att paraffin inbäddade vävnad. Det tillägg, det kan användas tillsammans med proprietär programvara såsom Imaris för ytterligare analys. Detta protokoll kan tillämpas på en mängd olika fysiologi och är inte begränsat till mikroglia men kan tillämpas på någon cell eller vävnad med särskilt mönster eller former som kan identifieras med IHC metoder. Slutligen, med tillräcklig urvalsstorlek, en multivariat eller kluster analys kan användas för att stratifiera mikroglia enligt morfologi12,21. Detta är meningsfull information som mikroglia morfologi är en viktig indikator på mikroglia funktioner och Svaren till sin omgivning. Uppskattning för mikrogliala morphologic mångfald är expanderande och viktigt att fullt ut förstå neuron-glia-vaskulär interaktioner under hälsa och sjukdom. Tillväxt inom detta område förstärks av välutvecklade, lätt att använda och reproducerbara protokoll att kvantifiera och sammanfatta mikroglia morfologi med flera kontinuerliga variabler.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie fick ekonomiskt stöd från NINR (F32NR013611). Vi vill ytterligare erkänna och tacka utvecklarna av AnalyzeSkeleton(2D/3D) och FracLac (Arganda-Carreras et al. och Karperien et al., respektive) utan som analysen beskrivs häri inte skulle vara möjligt.
primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |