Lys arks mikroskopi for tredimensjonale visualisering av menneskelig immunceller
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å visualisere immunceller i en tredimensjonal (3D) kollagen matrise med lys arks mikroskopi. Denne protokollen også utdyper hvordan spore celle migrasjon i 3D. Denne protokollen kan benyttes for andre typer suspensjon celler i 3D matrix.
Abstract
I vivo, aktivisering, spredning og funksjon av immunceller alle oppstå i et tredimensjonalt (3D)-miljø, for eksempel i lymfeknuter eller vev. Oppdatert avhengige de fleste i vitro systemer av todimensjonal (2D) overflater, for eksempel cellekultur plater eller coverslips. Optimalt etterligne fysiologiske forhold i vitrobruker vi en enkel 3D kollagen matrise. Kollagen er en av hovedkomponentene i ekstracellulær matrix (ECM) og har vært mye brukt å utgjøre 3D matriser. For 3D-bildebehandling, er nylig utviklet lys arks mikroskopi teknologien (også referert til som enkelt flyet belysning mikroskopi) kjennetegnet med høy oppkjøpet hastighet, store gjennomtrenging dyp, lav bleking og photocytotoxicity. Videre er lys-arks mikroskopi særlig fordelaktig for langsiktige mål. Her beskriver vi en optimalisert protokoll hvor sette og håndtere menneskelige immunceller, f.eks primære menneskelige cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og naturlig killer (NK) celler i 3D kollagen matrisen for bruk med lys arks mikroskopi for levende celle bildebehandling og fast prøver. Fremgangsmåten for bildeopptak og analyse av celle migrasjon presenteres. Et særlig fokus er gitt til markere avgjørende skritt og for eksempel forberedelse og dataanalyse. Denne kan benyttes for andre typer suspensjon celler i en 3D kollagen matrise og er ikke begrenset til immunceller.
Introduction
De fleste kunnskap om overføring cellene kommer fra 2D eksperimenter1,2,3, som normalt gjennomføres i et glass eller plast overflaten av kultur tenkelig parabolen. Imidlertid krever fysiologiske scenario i de fleste tilfeller en 3D microenvironment, der den ekstracellulære matrisen (EFM) spiller en avgjørende rolle. ECM ikke bare gir den 3D struktur avgjørende for å opprettholde riktig celle morfologi, men tilbyr også overlevelse signaler eller retningsbestemt signaler for en optimal funksjon av mange celler4,5 . Et 3D-miljø er derfor nødvendig å forbedre cellulære funksjoner og atferd i et miljø som er reflektere bedre fysiologisk sammenheng.
I menneskekroppen utøve de fleste celler spesielt immunceller, sine funksjoner under et 3D scenario. For eksempel aktivert T celler patruljere vev etter målcellene, naiv T celler vandrer gjennom lymfeknuter i Søk etter sine beslektet antigen-presentasjon celler der overføring modus og maskiner er tilpasset de tilsvarende ekstracellulære miljø3,6,7. 3D kollagen gel har vært mye brukt som en veletablert og godt karakterisert 3D celle kultur-systemet8,9,10. Våre tidligere arbeid viser at primære menneskelige lymfocytter er svært mobile og overføre med en gjennomsnittlig hastighet på rundt 4,8 µm/min i en 0.25% kollagen-baserte matrix11. Omorganisering av cytoskjelett spiller en nøkkelrolle i celle migrasjon12. Samler bevis viser at lymfocytter gjelder ikke bare et enkelt modus av migrasjon ennå kan bytte mellom visse migrasjon virkemåter avhengig av beliggenhet, microenvironment, cytokiner, chemotactic graderinger og ekstracellulære signaler som tune det vandrende atferd i ulike måter 3.
Pålitelig analysere immun celle funksjoner og atferd, for eksempel overføring, protrusion formasjon eller vesicula transport, er det stor fordel å kunne hente bilder i relativt store 3D volumer på en rask og pålitelig måte. For 3D-bildebehandling tilbyr nylig utviklet lys arks mikroskopi teknologien (også referert til som enkelt flyet belysning mikroskopi) en tilfredsstillende løsning13,14. Under bildebehandling oppkjøpet, genereres et tynt statisk lys ark for å belyse prøven. På denne måten, på fokus flyet, kan et stort område være opplyst samtidig uten at det påvirker av flyet cellene. Denne funksjonen kan en høy oppkjøpet hastighet med en drastisk redusert bleking og photocytotoxicity. I dette papir beskriver vi hvordan å visualisere primære menneskelige immunceller bruker lys arks mikroskopi og analysere overføringen i 3D scenario.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fleste i vitro analyser utføres på 2D underlag, for eksempel i cellekultur plater, Petri-retter eller på coverslips, mens i vivo celler, spesielt immunceller, oppleve mest en 3D microenvironment. Nye bevis viser at migrasjon av immunceller varierer mellom 2D og 3D scenarier17. Videre er uttrykket profiler av kreftceller også annerledes i 2D – og 3D-kulturperler vev18,19,20. Derfor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Institutt for klinisk Hemostaseology og transfusjon medisin for å gi donor blod. Carmen Hässig og Cora Hoxha for utmerket teknisk hjelp. Vi takker Jens Rettig (Saarland University) for endret pMAX vektor, Roland Wedlich-Söldner (Universitetet i Muenster) for den opprinnelige LifeAct-Ruby konstruksjonen og Christian Junker (Saarland University) for å generere den LifeAct-mEGFP konstruksjonen. Dette prosjektet ble finansiert av Sonderforschungsbereich 1027 (prosjekt A2 til B.Q.) og 894 (prosjekt A1 til M.H.). Lys arks mikroskopet ble finansiert av DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
