İnsan bağışıklık hücreleri üç boyutlu görselleştirme için ışık sayfalık mikroskobu
Summary
Burada, bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak üç boyutlu (3D) kolajen dizey içinde gömülü görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı da hücre göç 3D iz sürmeyi ayrıntılandırdığı. Bu iletişim kuralı 3D Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam edilebilir.
Abstract
Vivo, harekete geçirmek, yayılması ve bağışıklık hücreleri tüm fonksiyonu bir ortamında üç boyutlu (3D), örneğin lenf düğümleri veya doku oluşur. Tarihe kadar iki boyutlu (2D) yüzeyler, hücre kültürü plakaları veya coverslips gibi çoğu vitro sistemde güveniyor. En iyi şekilde kopyalama fizyolojik şartlarda vitroiçin biz basit 3D kollajen matris kullanmaktadır. Kollajen hücre dışı matriks (ECM) ana bileşenlerini ve yaygın olarak 3B matrisleri oluşturmak için kullanılan. 3D görüntüleme için (tek uçak aydınlatma mikroskobu da bilinir) son zamanlarda gelişmiş ışık sayfalık mikroskobu teknoloji yüksek satın alma hızı, büyük penetrasyon derinliği, düşük beyazlatma ve photocytotoxicity bulunmamaktadır. Ayrıca, ışık sayfalık mikroskobu özellikle uzun vadeli ölçüm için avantajlıdır. Burada nasıl ayarlamak ve insan bağışıklık hücreleri, Örneğin birincil insan sitotoksik T lenfositler (CTL) işlemek en iyi duruma getirilmiş bir protokolü açıklar ve doğal öldürücü (NK) hücreleri canlı hücre görüntüleme için ışık sayfalık mikroskobu ile kullanım için 3D kollajen matris ve sabit örnekleri. Resim alma ve çözümleme hücre göç prosedürü sunulmaktadır. Belirli bir odak kritik adımlar ve numune hazırlama ve veri analizi için etkenler vurgulamak için verilir. Bu iletişim kuralı bir 3D kollajen Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam ve bağışıklık hücreleri için sınırlı değildir.
Introduction
Geçiş hakkında birçok bilgi hücreleri gelir üzerinden 2D deneyleri1,2,3, hangi normal bir cam veya plastik yüzey bir kültür/görüntüleme yapılmaktadır çanak. Ancak, fizyolojik bir senaryo, çoğu durumda, hücre dışı matriks (ECM) belirleyici bir rol oynayan bir 3D microenvironment gerektirir. ECM sadece uygun hücre morfolojisi korumak için 3D yapısı temel sağlar ama aynı zamanda yaşam sinyalleri veya bir en uygun birçok hücre4,5 / işlemesi için yön ipuçları sunmaktadır. Bu nedenle, bir 3D çevre hücresel işlevler ve davranış fizyolojik içeriği daha iyi yansıtan bir ortamda daha iyi tanımlamak için gereklidir.
İnsan vücudunda en hücreleri özellikle bağışıklık hücreleri, onların işlevler’in altında bir 3D senaryo uygulamayın. Örneğin, aktive T hücreleri hedef hücreler için arama doku devriye, saf T hücreler lenf düğümleri sırasında geçiş modu ve makine ekstraselüler karşılık gelen için adapte olmuşlardır soydaş antijen sunan hücreler için arama üzerinden göç çevre3,6,7. 3D kollajen jel yaygın bir iyi kurulmuş ve iyi karakterize 3D hücre kültür sistemi8,9,10kullanılmıştır. Önceki çalışmalarımız birincil insan lenfosit son derece mobil ve yaklaşık 4.8 µm/dk % 0.25 kollajen tabanlı matris11‘ deki ortalama bir hızda geçiş gösterir. Sitoiskeleti düzenlenmesi Hücre geçiş12içinde önemli bir rol oynar. Kanıt biriken lenfosit göç sadece tek bir mod geçerli değildir henüz yer, microenvironment, sitokinler, kemotaktik degradeler bağlı olarak bazı geçiş davranışı arasında geçiş yapabilirsiniz ve ekstraselüler hangi melodi sinyalleri gösterir göçmen davranış farklı yolu 3.
Bağışıklık hücre fonksiyonları ve davranış, örneğin, göç, çıkıntı oluşumu veya veziküler ulaşım, güvenilir bir şekilde çözümlemek için görüntüleri nispeten büyük 3B cilt olarak hızlı ve güvenilir bir şekilde elde edebilmek için büyük avantaj taşımaktadır. 3D görüntüleme için tatmin edici bir çözüm13,14(tek uçak aydınlatma mikroskobu da bilinir) son zamanlarda gelişmiş ışık sayfalık mikroskobu teknoloji sunmaktadır. Edinme görüntüleme sırasında ince bir statik hafif levha örnek aydınlatmak için oluşturulur. Bu şekilde, odak düzlem üzerinde geniş bir alanda aynı anda uçak-hücreleri etkilemeden aydınlatılmış. Bu özellik, bir büyük ölçüde azaltılmış ağartma ve photocytotoxicity ile bir yüksek satın alma hızı sağlar. Bu yazıda, birincil insan bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak görselleştirmek ve 3D senaryosunda geçiş analiz anlatan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vivo hücreleri, özellikle bağışıklık hücreleri, çoğunlukla bir 3D microenvironment deneyim, ancak çoğu vitro deneyleri bir 2D yüzeyi, hücre kültürü kaplamalar, Petri yemekler veya coverslips, örneğin devam etmektedir. Kanıt ortaya çıkan geçiş desen bağışıklık hücrelerinin 2D ve 3D senaryoları17arasında farklılık gösterir. Ayrıca, tümör hücrelerinin ifade profilleri de 2D ve 3D kültürlü doku18,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz klinik Hemostaseology Enstitüsü ve kan nakli tıp donör kan sağlamak için teşekkür ederiz; Carmen Hässig ve Cora hoca mükemmel teknik yardım için. Biz için değiştirilmiş değerleri vektör Jens Rettig (Saarland Üniversitesi), Roland Wedlich-Söldner (Münster Üniversitesi) orijinal LifeAct-yakut inşa etmek için ve Christian Junker (Saarland Üniversitesi) LifeAct-mEGFP yapı oluşturmak için teşekkür ederiz. Bu proje Sonderforschungsbereich 1027 (proje A2 BQ) ve 894 (projeye A1 M.H.) tarafından finanse edildi. Işık sayfalık mikroskop DFG tarafından finanse edildi (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
