여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Vivo에서, 활성화, 확산, 그리고 모든 면역 세포의 기능 림프절 이나 조직에 예를 들어 3 차원 (3D) 환경에서 발생합니다. 최신, 대부분 체 외에 시스템 셀 문화 또는 coverslips와 같은 2 차원 (2D) 표면에 의존합니다. 최적의 모방 생리 조건에 생체 외에서우리는 간단한 3D 콜라겐 매트릭스를 활용합니다. 콜라겐은 세포 외 기질 (ECM)의 주요 구성 요소 중 하나입니다 그리고 3D 매트릭스 구성에 널리 사용 되 고 있다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 높은 수집 속도, 큰 침투 깊이, 낮은 표백 및 photocytotoxicity 기능입니다. 또한, 빛 시트 현미경 장기 측정을 위해 특히 유리 하다. 여기 우리는 최적화 된 프로토콜 설정 하 고 인간의 면역 세포, 예를 들어 기본 인간의 세포 독성 T 세포 (CTL)을 처리 하는 방법을 설명 하 고 라이브 셀 이미징에 대 한 빛-시트 현미경과 사용에 대 한 3D 콜라겐 매트릭스에 자연 킬러 (NK) 세포와 고정된 샘플입니다. 이미지 수집 및 세포 이동의 분석을 위한 절차 되 게 됩니다. 특히 초점 중요 한 단계 및 샘플 준비 및 데이터 분석에 대 한 요소를 강조 하기 위해 제공 됩니다. 이 프로토콜은 3D 콜라겐 매트릭스에 현 탁 액 셀의 다른 종류에 대 한 고용 수 있습니다 하 고 면역 세포에 국한 되지 않습니다.
서론
마이그레이션에 대 한 대부분 지식 세포에서 온다 2D는 일반적으로 유리 또는 플라스틱 표면 문화/이미징의 실시는1,2,3, 실험 접시. 그러나, 생리 적인 시나리오 필요, 대부분의 경우, 3D microenvironment, 기질 (ECM) 결정적인 역할을 담당 합니다. ECM 뿐만 아니라 적절 한 세포 형태를 유지 하기 위해 3 차원 구조 에센셜을 제공 하지만 또한 생존 신호 또는 많은 셀4,5 의 최적의 기능에 대 한 방향 신호를 제공 합니다. 따라서, 3D 환경이입니다 더 나은 휴대 전화 기능 및 생리 적 컨텍스트를 반영 하는 더 나은 환경에서 동작을 식별 하는 데 필요한.
인간의 신체에서 대부분 세포 면역 세포 특히 3D 시나리오에서 그들의 기능을 발휘 한다. 예를 들어 활성화 된 T 세포 순찰 조직 대상 셀에 대 한 검색, naïve T 세포 마이그레이션 기간 동안 마이그레이션 모드와 기계는 해당 하는 extracellular 적응 그들의 동족 항 원 제시 세포에 ....
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프로토콜
인간의 재료 (인간의 혈액 기증자 로부터 백혈구 감소 시스템 실)와 함께이 연구를 위해 실시 하는 연구 승인 지역 윤리 위원회 (16.4.2015 (84/15;에서 선언 교수 박사 Rettig Stürmer))와 해당 지침을 따릅니다.
1. 중화 콜라겐 솔루션의 준비 (500 µ L)
- 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 냉장된 콜라겐 재고 솔루션 (10.4 mg/mL)의 400 µ L를 전송. 천천히의 50 µ L 냉장 10 x PBS (pH 7.0-7.3) 냉장된 콜라겐 재고 솔루션의 400 µ L 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 타일링 하 여 솔루션을 믹스.
참고: 1 부의 모든 단계는 셀 문화 후드 행해져야 한다. - 1.1에서 콜라겐 솔루션의 500 µ L로 0.1 M NaOH의 8 µ L를 추가 합니다. pH 7.2-7.6를 조정 하려면 PH 시험 지구를 사용 하 여 (pH 범위: 6-10) 혼합물의 pH 값을 확인 하.
참고: 볼륨 콜라겐의 다른 일괄 처리에 대 한 달라질 수 있습니다. NaOH 솔루션을 공기 방울을 피하기 위해 천천히 혼합 될 수 있다. 혼합물을 콜라겐 겔 화를 피하기 위해 얼음에 보관 한다. - 추가 2 µ L 살 균 ddH2O 50....
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결과
T 세포 마이그레이션 중 돌출 형성 걸 의존 하는 매우 역동적인 프로세스입니다. 기본 인간 CTL의 돌출 형성을 시각화 하려면 우리는 뚜렷이11전에 설명한 대로 CTL에 말라 골격을 mEGFP 융합 단백질 페. Transfection, 후에 1 일 셀 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 이미지 스택 인수 했다 모든 40 단계-빛-시트 현미경을 사용 하 여 37 ° C에서 1 µ m의 크기와 함께 s. 같이 그림 2A 에 보충 영화 1, 마이그레이션 중 인간의 CTL 양식 주요 돌출 레몬 모양 좋은 스핀 들 모양의 구조에 의해 드리워진. 실험 같이, 뿐만 아니라 하나의 단일 셀은 몇 군데 있지만 큰 볼륨 (538 µ m3x 450 x 450)에서 (그림 2B). 따라서, 광학 품질.......
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토론
대부분 체 외에서 분석 vivo에서 세포, 면역 세포 특히 주로 3D microenvironment을 경험 하는 반면 2D 표면, 세포 배양 배지, 페 트리 접시 또는 coverslips, 예를에 밖으로 수행 됩니다. 증거를 신흥 면역 세포의 이동 패턴 2D 및 3D 시나리오17사이 다 보여줍니다. 또한, 종양 세포의 식을 프로필은 2D 및 3D 교양 조직18,,1920에서 다른도. 따라서, 최고의 시뮬레이션 시험관에생리 적 조건, 예를 들면 3D 콜라겐 매트릭스에서에서 3D 맥락에서 실험을 수행 하는 큰 장점은의입니다. 새로 개발된 된 접근, 특히 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 제어 환경 조건 하에서 3 차원 매트릭스 시스템에서 안정적이 고 재현 실험을 수 있습니다.
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공개 사항
저자는 금융 또는 상업적 충돌의 관심을 선언합니다.
감사의 글
우리 임상 Hemostaseology 연구소 및 수혈 의학 기증자 혈액;를 제공 하기 위한 감사 합니다. 카르멘 Hässig 및 우수한 기술 지원에 대 한 코 라 호자. 우리 LifeAct mEGFP 구조를 생성 하기 위한 수정된 pMAX 벡터에 대 한 옌스 Rettig (자를란트 대학), 롤랜드 Wedlich-용 병 (뮌스터 대학) 원래 LifeAct-루비 구문 및 기독교 고물 (자를란트 대학) 감사 합니다. 이 프로젝트는 Sonderforschungsbereich 1027 (B.Q. 프로젝트 A2)와 894 (수소 프로젝트 a 1)에 의해 투자 되었다. 빛-시트 현미경 DFG에 의해 투자 되었다 (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | 콜라겐 매트릭스 |
| 0.5 M NaOH 용액 | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | 저농도 c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | PBMC에서 일차 인간 CD8+ T 세포 분리 |
| T 세포 증식 및 활성화를 위한 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fisher | 11132D | CTL 집단의 활성화 |
| 인간 재조합 인터루킨-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | 배양 CTL |
| P3 1차 용액 키트 | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 항체, 토끼, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask 주황색 플라즈마 멤브레인 염색 | Thermo Fisher | C10045 | 형광 세포 라벨 |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco의 phopsphate 완충 식염수 | Thermo Fisher | 14190250 | |
| IF 소 혈청 알부민 | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α 토끼 568, IgG, 토끼 | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (광시트 현미경) | Zeiss | N.A. | |
| 세포 배양 후드 | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| 세포 배양 인큐베이터 HERACell 150i | 써모 피셔 | N.A. | |
| Centrifuge 5418 및 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| 피펫 | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| 피펫 팁 | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL 튜브 | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 모세혈관 50 &마이크로; L | VWR (브랜드) | 613-3373 | Zeiss LSFM 샘플 준비 |
| 캐필러리용 플런저 | VWR (브랜드) | BRND701934 | "테플론 팁이 있는 스탬프" LSFM 샘플 준비 |
| MColorPhast pH 스팁 | Merck | 1095430001 | 중화된 Fibricol |
| BD Plastipak 1mL 주사기 | BD | Z230723 ALDRICH | 대체 시료 준비 |
| 모델링 점토 (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris 파일 변환기 | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | 이미징 파일을 Imaris 파일 형식으로 변환 |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | 3D 및 4D 이미징 데이터 분석 |
참고문헌
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M.
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재인쇄 및 허가
