Характеристика водных биоплёнки с проточной цитометрии
Summary
Проточная цитометрия в сочетании с визуального кластеризации предлагает простой в использовании и быстрый метод для изучения водных биопленки. Он может использоваться для определения характеристик биопленки, обнаружения изменений в структуре сообществ биопленки и абиотических частиц, встроенных в биопленки.
Abstract
Биоплёнки являются динамические консорциумов микроорганизмов, которые играют ключевую роль в пресноводных экосистемах. Путем изменения их структуры сообщества, биоплёнки быстро реагировать на экологические изменения и таким образом может использоваться как показатели качества воды. В настоящее время оценки биопленки основана главным образом на комплексный и функциональный конечных точек, например фотосинтетической или дыхательной деятельности, которые не предоставляют информацию о структуре сообщества биопленки. Проточной цитометрии и вычислительной визуализации предлагают альтернативных, конфиденциальные и easy-to-use метод для оценки состава сообщества, особенно в фотоавтотрофная части пресноводных биопленки. Он требует только основные пробоподготовки, после чего весь образец выполняется через проточный цитометр. Одноклеточных оптических и флуоресцентные информация используется для компьютерной визуализации и биологическая интерпретация. Его основные преимущества перед другими методами являются скорость анализа и высоким содержанием информации природы. Проточной цитометрии предоставляет информацию о нескольких сотовых и биопленки черты в одном измерении: размер частиц, плотность, содержание пигмента, абиотические содержание в биопленки и грубый таксономической информации. Однако он не представить информацию о составе биопленки на уровне видов. Мы видим большой потенциал в использовании метода для мониторинга окружающей среды водных экосистем и как оценку первоначальных биопленки шаг, который информирует вниз по течению подробные расследования дополнительные и более подробные методами.
Introduction
Биоплёнки являются динамические консорциумов микроорганизмов, которые играют ключевую роль в пресноводных экосистемах, начиная от первичного производства, питательных и очистки воды для влияния на распределение микроорганизмов и их биоразнообразия в экосистеме 1. когда биоплёнки подвергаются к изменяющимся условиям окружающей среды или на раздражители, такие как химических веществ, их структуры сообщества быстро переходит к более терпимым видов2,3. Их высокая чувствительность превращается биопленки в привлекательные модели систем для экологического мониторинга4, однако ни один из нынешних методов идеально подходит для фактически проследить динамику биопленки сообщества в быстрый и легкий путь.
Часто используемый набор методов для описания биоплёнки состоит из измерения функциональных и структурных конечных точек. На уровне всего сообщества активность фотосинтеза и дыхания, а также активность внеклеточных ферментов содержит информацию о функционального состояния биопленки5,6,7,8 ,9. Накопление биомассы используется в качестве индикатора для общего роста биопленки. Структурные изменения в настоящее время измеряются, либо с помощью идентификации традиционных видов световой микроскопии или с нуклеотидом-методов (например, денатурации градиента гель-электрофорез (DGGE), автоматизированные рибосомных intergenic прокладку анализ (ARISA), метагеномики)10,,1112. Эти методы предоставляют информацию, но много времени для выполнения, или требуют специальных знаний или находятся в стадии разработки. Наконец новые методы для оценки внеклеточного полимерных веществ (EPS)13,14 и биопленки архитектура1, тогда как чувствительных, низкой пропускной способностью и еще не были разработаны к мониторинга целей.
Очевидно, что для полной характеристики пресноводных биопленки, это необходимо объединить несколько различных методов, которые обеспечивают понимание биопленки функции, состав и архитектуры. Для мониторинга окружающей среды, с другой стороны, метод быстрый и чувствительной, который способен обнаружить изменения в биопленки и включить основные биологические интерпретации сдвигов на уровне функциональных и структурных не требуется.
Мы разработали новый метод для определения характеристик микробных фототрофных компонента потока биоплёнки (перифитон), которая достаточно быстро для целей мониторинга и в то же время обеспечивает достаточную информацию о биопленки сообщества структура, позволяющая биологическая интерпретация15. Она основана на одной ячейки проточной цитометрии (FC) образцов биопленки и в сочетании с компьютерной визуализации и предоставляет информацию о оптические и флуоресцентные свойства биопленки на уровне одной ячейки.
Рабочий процесс после выборки биопленки состоит из подготовки проб в виде sonication, фиксация и размер-фильтрацию на основе образцов, следуют оценки выборки подачей cytometry. Полученные данные представить информацию о нескольких сотовых черты в одном измерении: размер частиц, плотность, содержание пигмента, абиотические содержание (например , частицы) биопленки. Этот набор данных не проанализированы через вычислительной визуализации с помощью визуальных стохастических соседа, встраивание (viSNE)16, который позволяет быстро и легко интерпретации данных. Хотя несколько недель требуются для настройки и оптимизации метода, после установки, он занимает всего несколько часов от сбора проб биопленки для интерпретации результатов.
Основные преимущества метода представленные над другими являются скорость анализа и высоким содержанием информации. Кроме того образцы можно хранить в течение нескольких недель после сбора без потери их оптических и флуоресценции свойства. Это может быть очень полезно, когда характеристика большое количество образцов не требуется, например большие выборки исследования или программы биомониторинга, но также может обеспечить значительное количество информации в небольших разведочных исследований.
Представленные протокол основывается на анализе потока гранулярных фототрофных биоплёнки (перифитон), собранных из разных мест потока. Многие действия протокола, например выбор мест для целей контроля зависит от целей исследования и поэтому не может быть предписано. Другие позволяют меньше свободы и требуют что внимательно следил за протокол, это стало ясно в протоколе подробно ниже.
Протокол начинается с выбора участков для мониторинга окружающей среды на основе биопленки. Следующий шаг заключается в настройке проточный цитометр (FC) таким образом, чтобы его размеры позволяют дискриминации между различными фототрофных организмы, живущие в биопленки в контролируемых условиях. Это осуществляется путем сбора образцов биопленки от сайтов, выявления флуоресцентные свойства различных видов в биопленки и Настройка потока цитометр с лазерами и фильтров, позволяющих измерение на соответствующие оптические длин волн. После установки, ФК биоплёнки может быть собраны из сайты периодически, оптические и флуоресцентные свойства единого частиц, присутствующих в биопленки, измеряется проточной цитометрии и данные анализируются визуального кластеризации. За лучшую интерпретацию результатов можно построить ФК справочной базы данных видов местных биопленки жизни и их фенотипы и использовать базу данных для выявления различных классификаций в ФК данных. Проверка возможна через флуоресценции-сортировка на основе выявленных кластеров одиночных клеток с помощью СУИМ и микроскопии основанные таксономической идентификации видов настоящего. На рисунке 1приводится схема протокола.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, в описанный выше относительно просто реализовать. Однако в то время как параметры представлены по умолчанию было показано, чтобы быть пригодным для всех фототрофных биопленки, испытаны до настоящего времени, оптимизация (как описано в протоколе) необходимо максимизировать и?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Представленная работа была поддержана SNF Ambizione стипендий (PZ00P2_142533) и Velux исследовательский грант (Amplebig). Мы хотели бы поблагодарить Bettina Вагнера за помощь с экспериментальной работы.
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton – comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. . Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry – Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
