אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה
Summary
Cytometry זרימה בשילוב עם קיבוץ באשכולות חזותית מציע שיטה קלה לשימוש ומהיר עבור הלומדים biofilms הימית. זה יכול לשמש biofilm אפיון, זיהוי שינויים במבנה הקהילה biofilm, וזיהוי של חלקיקים והאביוטיים שמוטבע על biofilm.
Abstract
Biofilms הם קונסורציומים דינמי של מיקרואורגניזם לשחק תפקיד מפתח מערכות אקולוגיות מים מתוקים. על ידי שינוי המבנה הקהילתי שלהם, biofilms להגיב במהירות לשינויים סביבתיים, יכול לשמש ובכך גם אינדיקטורים של איכות המים. כיום, biofilm הערכה זו מבוססת בעיקר על אינטגרטיבי פונקציונלי הקצה, כגון פעילות פוטוסינתטיים או הנשימה, אשר אינם מספקים מידע על מבנה הקהילה biofilm. Cytometry זרימה והדמיה חישובית מציעים שיטה חלופית רגיש, קל לשימוש עבור הערכה של הרכב הקהילה, במיוחד של החלק photoautotrophic של biofilms מים מתוקים. זה דורש רק בסיסי הכנת הדוגמא, אחרי אשר המדגם כולו הוא לעבור את cytometer זרימה. החד-תאיים אופטי פלורסנט ומידע משמש עבור ויזואליזציה חישובית ופרשנות ביולוגי. היתרונות העיקריים שלה על פני שיטות אחרות הם המהירות של ניתוח והטבע גבוהה-מידע-תוכן. Cytometry זרימה מספקת מידע על מספר התכונות הסלולר והדואר biofilm מידה יחיד: גודל החלקיקים, צפיפות, פיגמנט תוכן, תוכן והאביוטיים biofilm ולאחר מידע טקסונומי גס. אולם, הוא אינו מספק מידע על הרכב biofilm ברובד מינים. אנו רואים פוטנציאל גבוה בשימוש של השיטה עבור ניטור סביבתי של המערכת האקולוגית הימית, כמו הערכה ראשונית biofilm השלב, המיידע במורד הזרם מפורט חקירות על ידי שיטות משלימות ומפורט יותר.
Introduction
Biofilms הם קונסורציומים דינמי של מיקרואורגניזם לשחק תפקיד מפתח מערכות אקולוגיות מים מתוקים, החל הייצור הראשוני, רכיבה על אופניים מזין, טיהור מים המשפיעים על ההתפלגות של מיקרואורגניזמים, שלהם הביולוגי של המערכת האקולוגית 1. כאשר biofilms חשופים לתנאי הסביבה המשתנים או לחצים, כגון כימיקלים, מבנה הקהילה שלהם משתנה במהירות כלפי מינים יותר סובלנית2,3. רגישות גבוהה שלהם הופכת biofilms מודל אטרקטיבי מערכות ניטור סביבתי4, אולם אף אחת משיטות הנוכחי מתאים באופן מושלם לאתר למעשה את הדינמיקה של קהילה biofilm בצורה קלה ומהירה.
ערכת נפוץ של שיטות לאפיון biofilms מורכב המדד של נקודות קצה תפקודית ומבניים. ברמה של הקהילה כולה, פעילות פוטוסינתטיים, מערכת הנשימה, כמו גם הפעילות של אנזימים חוץ-תאית מספק מידע אודות למצב התפקודי של biofilm5,6,7,8 ,9. התשלום של ביומסה משמש כמחוון לצמיחה biofilm הכללית. שינויים מבניים נמדדים כיום גם על ידי שימוש לזן מסורתי עם מיקרוסקופ אור או עם טכניקות מבוססות נוקלאוטיד (למשל, denaturing הדרגתיות בג’ל (DGGE), מרווח intergenic ribosomal אוטומטיות ניתוח (ARISA), metagenomics)10,11,12. שיטות אלה מספקים מידע אבל הם זמן רב לביצוע, או דורשים ידע ספציפי, או נמצאים עדיין בשלבי פיתוח. לבסוף, שיטות חדשות על ההערכה של13,חוץ-תאית חומרים פולימריים (EPS)14 , biofilm אדריכלות1, תוך רגישות, תפוקה נמוכה, לא פותחו עדיין כלפי למטרות ניטור.
זה ניכר כי עבור אפיון מלא של מים מתוקים biofilms, יש צורך לשלב מספר שיטות שונות, אשר מספקים תובנה biofilm פונקציה, הרכב ואת הארכיטקטורה. עבור ניטור סביבתי, מצד שני, שיטה מהירה רגיש כי הוא מסוגל לזהות שינויים biofilm ולאפשר הפירוש הביולוגי הבסיסי משמרות ברמה תפקודית ומבניים נדרש.
פיתחנו שיטה חדשה עבור הקהילה מיקרוביאלי אפיון של הרכיב phototrophic של זרם biofilms (periphyton), אשר מהיר מספיק למטרות ניטור, באותו זמן מספק מספיק מידע על קהילת biofilm מבנה כדי לאפשר פרשנות ביולוגי15. בהתבסס על cytometry זרימה בתא יחיד (FC) דוגמאות biofilm, בשילוב עם ויזואליזציה חישובית ומספק מידע על מאפיינים אופטיים, פלורסנט של biofilm ברמה תא בודד.
זרימת העבודה לאחר דגימה biofilm כוללת הכנת הדוגמא בדמות sonication, קיבוע, המבוססת על גודל סינון של הדגימות ואחריו הערכת המדגם על ידי cytometry זרימה. הנתונים שהושגו לספק מידע על מספר תכונות הסלולר במידה יחיד: גודל החלקיקים, צפיפות, פיגמנט תוכן, תוכן והאביוטיים (למשל microplastics) biofilm. קבוצת נתונים זו הינו מ נותחו באמצעות ויזואליזציה חישובית באמצעות חזותי השכן סטוכסטי הטבעה (viSNE)16, אשר מאפשרת פרשנות קלה ומהירה של הנתונים. למרות כמה שבועות נדרשים להגדיר ולשפר את השיטה, לאחר ההגדרה, זה לוקח רק כמה שעות של איסוף הדגימות biofilm לפרש את התוצאות.
היתרונות העיקריים של שיטת שהוצגו על פני האחרים הם המהירות של ניתוח גבוהה-מידע-תוכן. יתר על כן, ניתן לאחסן את הדגימות למשך מספר שבועות אחרי אוסף ללא אובדן שלהם אופטי ומאפיינים זריחה. זה יכול להיות שימושי מאוד בעת אפיון של מספר רב של דוגמאות נדרש, כגון מחקרים דגימה גדולה או תוכניות אפידמיולוגיה סביבתית, אך יכול גם לספק כמות משמעותית של מידע קטן גישוש במחקרים.
פרוטוקול הציג מבוסס על ניתוח תזרים-cytometric של biofilms phototrophic (periphyton) שנאספו ממקומות שונים של זרם. שלבים רבים של הפרוטוקול, למשל מבחר אתרים המתאימים למטרות, ניטור תלויים מטרות המחקר, ולכן לא יכול שייקבעו. אחרים מאפשרים פחות חופש ודורשים כי הפרוטוקול מלווה מקרוב, זה נעשה ברור בפרוטוקול מפורט להלן.
הפרוטוקול מתחיל עם המבחר של אתרים מבוססי biofilm ניטור סביבתי. השלב הבא הוא שיבנו הזרימה-cytometer (FC) כך המידות שלה לאפשר אפליה בין אורגניזמים שונים phototrophic המתגוררים biofilms בסביבת תחת פיקוח. זה מבוצע על ידי איסוף דגימות biofilm מן האתרים, זיהוי מאפייני מינים שונים נוכח את biofilm והגדרת את הזרימה-cytometer עם לייזרים ומסננים המאפשרים מדידה ב המתאים אופטי פלורסנט אורכי גל. ברגע מועדון הכדורגל כבר הגדרת, biofilms יכול להיות שנאספו מן האתרים מעת לעת, המאפיינים אופטי ו פלורסנט של החלקיקים יחיד נוכח את biofilm נמדדת cytometry זרימה, ואת הנתונים נותחו על ידי קיבוץ באשכולות חזותי. לפרשנויות טוב יותר של התוצאות, זה אפשרי לבנות מסד נתונים הפניה FC של המינים biofilm-החיים המקומי, פנוטיפים שלהם, להשתמש במסד הנתונים לזיהוי מיונים שונים בנתוני ה-FC. אימות הוא אפשרי דרך המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית מיון האשכולות מזוהה של תאים בודדים באמצעות FACS מבוסס מיקרוסקופיה זיהוי טקסונומי של המין האנושי הנוכחי. תיאור סכמטי של הפרוטוקול ניתנת באיור1.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המתואר לעיל הוא פשוט יחסית ליישום. עם זאת, בעוד הגדרות ברירת המחדל הציג הוכחו מתאים biofilm כל phototrophic נבדקו עד כה, אופטימיזציה (כמתואר בפרוטוקול) יש צורך למקסם את המידע המתקבל בשיטת. אכן, אופטי, פלורסנט מאפייני biofilms יכול להשתנות, בהתאם התנאים הסביבתיים (העונה, הטמפרטורה, ההרכב הכימי של …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה הציג נתמכה על ידי מלגת Ambizione SNF (PZ00P2_142533) ומענק מחקר Velux (Amplebig). ברצוננו להודות בטינה וגנר לעזרה במציאת עבודה ניסויית.
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton – comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. . Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry – Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
