Протокол для создания хронических ран у диабетических мышей

Summary

Хронические раны развиваются из острых ран на диабетической модели мыши, вызывая высокий уровень окислительного стресса после полной толщины кожной раны. Рана лечится ингибиторами для каталазы и глутатиона пероксидазы, в результате чего нарушения заживления и развития биопленки бактериями, присутствующими в микробиоме кожи.

Abstract

Хронические раны развиваются в результате дефектной регуляции в одном или нескольких сложных клеточных и молекулярных процессах, участвующих в правильном заживлении. Они влияют на людей в размере 6,5 млн евро и обходятся в 40 млрд евро в год только в США. Хотя значительные усилия были вложены в понимание того, как хронические раны развиваются у людей, фундаментальные вопросы остаются без ответа. Недавно мы разработали новую модель мыши для диабетических хронических ран, которые имеют много характеристик человеческих хронических ран. Использование db/db^-/- мышей, мы можем генерировать хронические раны, вызывая высокий уровень окислительного стресса (ОС) в раневой ткани сразу после ранения, используя одноразовое лечение ингибиторами, специфичными для антиоксидантных ферментов каталазы и глутатион пероксидаза. Эти раны имеют высокий уровень ОС, развивать биопленку естественно, становятся полностью хроническими в течение 20 дней после лечения и может оставаться открытым более чем на 60 дней. Эта новая модель имеет много особенностей диабетических хронических ран у людей и, следовательно, может внести значительный вклад в продвижение фундаментального понимания того, как раны становятся хроническими. Это большой прорыв, потому что хронические раны у людей вызывают значительную боль и страдания пациентов и привести к ампутации, если нерешенными. Кроме того, эти раны являются очень дорогими и отнимают много времени для лечения, и привести к значительной потере личного дохода для пациентов. Достижения в этой области исследования с помощью нашей хронической модели раны может значительно улучшить здравоохранение для миллионов людей, которые страдают в соответствии с этим изнурительным состоянием. В этом протоколе мы подробно описываем процедуру причинения острых ран, чтобы стать хроническими, чего раньше не делалось.

Introduction

Заживление ран включает в себя сложные клеточные и молекулярные процессы, которые временно и пространственно регулируются, организованы в последовательных и перекрывающихся стадиях, которые включают в себя множество различных типов клеток, включая, но не ограничиваясь иммунным ответом и сосудистыми система¹. Сразу же после того, как кожа выдерживает травмы, факторы и кровяные клетки агрегируются в месте раны и инициировать каскад коагуляции, чтобы сформировать сгусток. После гомеостаза кровеносные сосуды удаляется, чтобы впустить в рану участок кислорода, питательных веществ, ферментов, антител и хемотактических факторов, которые хемопривлекательные полиморфонуклеоциты, чтобы очистить раневое ложе иностранного мусора и выделяют протеолитические ферменты ². Активированные тромбоциты выделяют различные факторы роста, чтобы стимулировать кератиноциты на краю раны, чтобы повторно эпителиализировать раненый участок. Моноциты, завербованные в рану, дифференцируются в макрофаги, которые бактерии фагоцитов и мертвые нейтрофилы и выделяют дополнительные факторы для поддержания пролиферативного и промиграторного сигнала кератиноцитов. В фазе распространения, в то время как реэпителиализация продолжается, новая ткань гранулирования, состоящая из фибробластов, моноцитов / макрофагов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток, продолжает процесс восстановления². Ангиогенез стимулируется путем поощрения пролиферации эндотелиальных клеток и миграции, что приводит к разработке новых судов. Эпителилиизация и реконструкция внеклеточной матрицы подоравлетокружающе барьер против окружающей среды. Как рана заживает и гранулирования ткани развивается в шрам, апоптоз устраняет воспалительные клетки, фибробласты, и эндотелиальные клетки, не вызывая дополнительного повреждения тканей. Прочность ткани усиливается за счет фибробластов, реконструирующих различные компоненты внеклеточной матрицы, таких как коллаген, так что вновь сформированная ткань почти такая же сильная и гибкая, как и невредичная кожа^2.

Любое отклонение от этого высоко согласованного прогрессирования к замыкания ран приводит к нарушениям и/или хроническим ранам³. Хронические раны характеризуются повышенным окислительным стрессом, хроническим воспалением, поврежденным микроваскуляром и аномальной коллагеновой матрицей в ране^4. Оксидативный стресс, особенно в ране, может задержать закрытие^раны2,5. Когда на первом этапе заживления ран воспалительные фазы становятся нерегулируемыми, ткань хозяина предполагает значительный ущерб из-за постоянного притока воспалительных клеток^5, которые высвобождают цитотоксические ферменты, увеличение свободных кислородных радикалов и нерегулируемых воспалительных посредников, приводящих к гибели клеток^6,7.

В этой разрушительной микросреде биопленкообразующие бактерии используют питательные вещества хозяина и способствуют повреждению ткани хозяина^2. Эти биопленки трудно контролировать и удалять, потому что гидратированные внеклеточные полимерные вещества, состоящие из белков, ДНК, РНК и полисахаридов, позволяют бактериям, укрытым внутри, быть терпимыми к обычной антибиотикотерапии и уклоняться от врожденный и адаптивный иммунный ответ хозяина^2,8,9.

Изучение хронических ран имеет решающее значение, поскольку они влияют на 6,5 миллионов человек и стоят 40 миллиардов фунтов стерлингов в год только в США¹⁰. Пациенты с диабетом имеют повышенный риск развития хронических ран, которые требуют ампутации, с тем чтобы сдержать распространение инфекции. Эти пациенты имеют 50% риск смертности в течение 5 лет ампутации, что связано с патофизиологией механизм диабета¹¹. Взаимосвязь между иммунной системой хозяина и микробиом в заживлении ран является жизненно важной темой текущих исследований, потому что последствия хронических ран, если не решены, включают ампутацию и смерть¹².

Хотя значительные усилия были вложены в понимание того, как хронические раны развиваются у людей, до сих пор неясно, как и почему образуются хронические раны. Эксперименты по изучению механизмов нарушения заживления трудно проводить у человека, а специалисты по заживлению ран видят только пациентов с хроническими ранами, которые уже достигли хроники в течение нескольких недель и месяцев. Таким образом, специалисты не в состоянии изучить, какие процессы пошли не так, что привести рану развиваться, чтобы стать хроническим². Существует отсутствие моделей животных, которые резюмируют сложность человеческих хронических ран. До тех пор, пока наша модель не была разработана, никакой модели для хронических исследований ран не существовало.

Хроническая модель раны была разработана у мышей, которые имеют мутацию в рецепторе лептина(db/db^-/-)¹³. Эти мыши страдают ожирением, диабетом, и имеют нарушения исцеления, но не развиваются хронические раны¹⁴. Уровень глюкозы в крови в среднем около 200 мг/дл, но может достигать 400 мг/дл^15. При высоком уровне окислительного стресса (ОС) в раневой ткани индуцируют сразу после ранения, рана становится хронической^16. Db/db^-/- раны считаются хроническими на 20 дней и остаются открытыми в течение 60 дней или более. Биопленка, производимая бактериями, начинаетразвиваться через три дня после ранения; зрелый биопленку можно увидеть через 20 дней после ранения и сохраняется до тех пор, пока либо замыкания раны. Биопленкообразующие бактерии, которые мы находим у этих мышей, также встречаются в хронических ранах диабетиков человека.

Оксидативный стресс индуцируется путем лечения ран с двумя ингибиторами антиоксидантных ферментов, каталазы и глутатиона пероксидазы, два фермента с возможностью расщеплять перекись водорода. Перекись водорода является реактивным видом кислорода и может вызвать повреждение клеток в результате окисления белков, липидов и ДНК. Каталаза катализа катализа разложения перекиси водорода в менее вредных химических веществ кислорода и воды. 3-Амино-1,2,4-триазол (АТЗ) ингибирует каталазу, связывая конкретно и ковалентно к активному центру фермента, инактивируя его^17,18,19. АТЗ был использован для изучения последствий окислительного стресса как в пробирке и in vivo через ингибирование каталазы^{20,21,22,23,24}. Глутатион пероксидаза катализа сокращение перекиси водорода через антиоксидант, глутатион, и является важным ферментом, который защищает клетку от окислительного стресса²⁵. Меркаптосуччиновая кислота (MSA) ингибирует глутатион пероксидазы путем связывания с селеноцистена активного участка фермента с тиол, инактивируя его²⁶. MSA был использован для изучения последствий окислительного стресса in vitro и in vivo, а также^20,27,28.

Эта новая модель хронических ран является мощной моделью для изучения, поскольку она разделяет многие из тех же особенностей наблюдается в человека диабетической хронических ран, в том числе длительное воспаление от увеличения ОС и естественного образования биопленки из микробиома кожи. Раны имеют нарушение кожно-эпидермального взаимодействия, аномальные матричные осаждения, плохой ангиогенез и поврежденные сосуды. Хронические раны будут развиваться как у мужчин, так и у самок мышей, поэтому оба пола могут быть использованы для изучения хронических ран. Таким образом, хроническая модель раны может внести значительный вклад в углубление фундаментального понимания того, как такие раны начинаются. Использование этой хронической модели раны может дать ответы на фундаментальные вопросы о том, как хроника инициируется / достигается за счет вклада от физиологии нарушения заживления ран и микробиом хозяина.

Protocol

Все эксперименты были завершены в соответствии с федеральными правилами и политикой и процедурами Калифорнийского университета, утвержденными Калифорнийским университетом в Риверсайдском iacUC. 1. Зверь Используйте диабетические и ожирениеb B6. BKS (D)-Leprdb/J м…

Representative Results

На рисунке 5 показан пример раны без лечения ингибиторов, идущих к закрытию раны, и рана с лечением ингибиторов, прогрессирующих в направлении хроническости. Прозрачная повязка была оставлена на месте на хронической раны, так что биопленка и накопление…

Discussion

После того, как хронические раны создаются на мышах, модель может быть использована для изучения нарушенных процессов заживления ран, участвующих в инициировании хроники. Модель также может быть использована для проверки эффективности широкого спектра химических веществ и препарато?…

Materials

B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers