بروتوكول لخلق الجروح المزمنة في الفئران السكري
Summary
يتم تطوير الجروح المزمنة من الجروح الحادة على نموذج الماوس السكري عن طريق تحفيز مستويات عالية من الإجهاد التأكسدي بعد جرح جلدي كامل السماكة. يتم علاج الجرح مع مثبطات للكاتالاز والجلوتاثيون بيروكسيداز، مما أدى إلى ضعف الشفاء وتطوير biofilm من قبل البكتيريا الموجودة في ميكروبيوم الجلد.
Abstract
تتطور الجروح المزمنة نتيجة للتنظيم المعيب في واحدة أو أكثر من العمليات الخلوية والجزيئية المعقدة التي تنطوي على الشفاء السليم. أنها تؤثر على ~ 6.5M الناس وتكلفة ~ $40B / سنة في الولايات المتحدة وحدها. على الرغم من أنه تم بذل جهد كبير في فهم كيفية تطور الجروح المزمنة في البشر، لا تزال الأسئلة الأساسية دون إجابة. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير نموذج فأر جديد للجروح المزمنة السكرية التي لها العديد من خصائص الجروح المزمنة البشرية. باستخدام db/db-/- الفئران، يمكننا توليد الجروح المزمنة عن طريق تحفيز مستويات عالية من الإجهاد التأكسدي (OS) في أنسجة الجرح مباشرة بعد الإصابة، وذلك باستخدام علاج لمرة واحدة مع مثبطات محددة للإنزيمات المضادة للأكسدة catalase وcatalase الجلوتاثيون بيروكسيداز. هذه الجروح لديها مستويات عالية من نظام التشغيل، وتطوير biofilm بشكل طبيعي، وتصبح مزمنة تماما في غضون 20 يوما بعد العلاج، ويمكن أن تبقى مفتوحة أكثر لأكثر من 60 يوما. هذا النموذج الجديد لديه العديد من الميزات من الجروح المزمنة السكري في البشر، وبالتالي يمكن أن تسهم بشكل كبير في تعزيز الفهم الأساسي لكيفية الجروح تصبح مزمنة. وهذا إنجاز كبير لأن الجروح المزمنة في البشر تسبب آلاما وكربا كبيرة للمرضى وتؤدي إلى بتر الأطراف إذا لم تحل. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الجروح مكلفة للغاية وتستغرق وقتا طويلا لعلاجها، وتؤدي إلى خسارة كبيرة في الدخل الشخصي للمرضى. التقدم في هذا المجال من الدراسة من خلال استخدام نموذج الجرح المزمن لدينا يمكن أن تحسن بشكل كبير الرعاية الصحية للملايين الذين يعانون في ظل هذه الحالة المنهكة. وفي هذا البروتوكول، نوصف بتفصيل كبير الإجراء الذي يسبب الجروح الحادة لتصبح مزمنة، وهو ما لم يحدث من قبل.
Introduction
يتضمن التئام الجروح العمليات الخلوية والجزيئية المعقدة التي يتم تنظيمها زمنياً ومكانياً، وتنظم في مراحل متتابعة ومتداخلة تشمل العديد من أنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الاستجابة المناعية والأوعية الدموية النظام1. مباشرة بعد الجلد يعاني من إصابة، والعوامل وخلايا الدم تتجمع إلى موقع الجرح والشروع في تتالي تخثر لتشكيل جلطة. بعد تحقيق التوازن، تمدد الأوعية الدموية للسماح للأكسجين في موقع الجرح، والمواد الغذائية، والأنزيمات، والأجسام المضادة والعوامل الكيميائية التي تجذب الخلايا المتعددة الأشكال إلى إزالة الجرح من الحطام الأجنبي وإفراز الإنزيمات البروتيوليتيك 2.تفرز الصفائح الدموية المنشطة مجموعة متنوعة من عوامل النمو لتحفيز الخلايا الكيراتينية على حافة الجرح لإعادة epitheliliize المنطقة المصابة. الخلايا الأحادية التي تم تجنيدها إلى موقع الجرح تميز في الضامة التي البكتيريا phagocytose والعدلات الميتة وتفرز عوامل إضافية للحفاظ على إشارات الكيراتينية التكاثرية والمؤيدة للهجرة. في مرحلة الانتشار ، في حين تستمر إعادة الظهارة ، تستمر أنسجة التحبيب الجديدة المكونة من الخلايا الليفية ، والخلايا الأحادية /الضامة ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا البطانية في عملية إعادة البناء2. يتم تحفيز تكوين الأوعية الدموية من خلال تعزيز انتشار الخلايا البطانية والهجرة، مما يؤدي إلى تطوير سفينة جديدة. Epithelialization وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية بناء حاجز ضد البيئة. كما يشفي الجرح وتحبيب الأنسجة يتطور إلى ندبة، والمبرمج يزيل الخلايا الالتهابية، والخلايا الليفية، والخلايا البطانية دون التسبب في تلف الأنسجة إضافية. يتم تعزيز قوة الشد من الأنسجة عن طريق الخلايا الليفية إعادة عرض مكونات مختلفة من المصفوفة خارج الخلية، مثل الكولاجين، بحيث الأنسجة شكلت حديثا هو تقريبا قوية ومرنة مثل الجلد غير المصاب2.
أي انحراف عن هذا التقدم المتضافر للغاية نحو إغلاق الجرح يؤدي إلى ضعف و / أو الجروح المزمنة3. وتتميز الجروح المزمنة بزيادة الإجهاد التأكسدي، والتهاب مزمن، وmicrovasculature التالفة، ومصفوفة الكولاجين غير طبيعية في الجرح4. الإجهاد التأكسدي، وخاصة في الجرح، يمكن أن يؤخر إغلاق الجرح2،5. عندما، في المرحلة الأولى من التئام الجروح، تصبح المرحلة الالتهابية غير منظمة، والأنسجة المضيفة يفترض ضررا كبيرا بسبب التدفق المستمر للخلايا الالتهابية5 التي تطلق الإنزيمات السامة للخلايا، وزيادة في الجذور الأكسجين الحرة، و الوسطاء الالتهابية غير المنظمة، مما أدى إلى وفاة الخلية6،7.
في هذه البيئة الدقيقة المدمرة، البكتيريا التي تشكل biofilm الاستفادة من المواد الغذائية المضيفة والمساهمة في تلف الأنسجة المضيفة2. هذه biofilms من الصعب السيطرة عليها وإزالتها لأن المواد البوليمرية خارج الخلية رطبة تتكون من البروتينات، الحمض النووي، RNA، والسكريات يسمح البكتيريا التي تأوي داخل لتكون متسامحة مع العلاجات المضادات الحيوية التقليدية والتهرب من استجابة المناعة الفطريةوالتكيفية 2،8،9.
دراسة الجروح المزمنة أمر بالغ الأهمية لأنها تؤثر على ~ 6.5 مليون شخص وتكلف ~ 40 مليار دولار سنويا في الولايات المتحدة وحدها10. المرضى الذين يعانون من مرض السكري قد زادت من مخاطر الإصابة بالجروح المزمنة التي تتطلب بتر الأطراف من أجل احتواء انتشار العدوى. هؤلاء المرضى لديهم خطر الوفاة 50٪ في غضون 5 سنوات من البتر الذي يعزى إلى آلية الفيزيولوجيا المرضية لمرض السكري11. العلاقة بين الجهاز المناعي للمضيف والميكروبيوم في التئام الجروح هو موضوع حيوي من البحوث الجارية لأن عواقب الجروح المزمنة، إذا لم يتم حلها، وتشمل بتر والوفاة12.
على الرغم من أنه تم بذل جهد كبير في فهم كيفية تطور الجروح المزمنة في البشر، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ولماذا تشكل الجروح المزمنة. من الصعب إجراء تجارب لدراسة آليات ضعف الشفاء في البشر، ولا يرى أخصائيو التئام الجروح سوى المرضى الذين يعانون من الجروح المزمنة التي وصلت بالفعل إلى المزمنة لأسابيع إلى أشهر. وهكذا، فإن المتخصصين غير قادرين على دراسة ما هي العمليات التي ذهبت خطأ التي تؤدي إلى تطور الجرح لتصبح مزمنة2. هناك نقص في النماذج الحيوانية التي تلخص تعقيد الجروح البشرية المزمنة. وحتى تم تطوير نموذجنا، لم يكن هناك نموذج لدراسات الجروح المزمنة.
تم تطوير نموذج الجرح المزمن في الفئران التي لديها طفرة في مستقبلات اللبتين(db/db-/-)13. هذه الفئران هي السمنة والسكري، وتعاني من ضعف الشفاء ولكن لا تتطور الجروح المزمنة14. متوسط مستويات الجلوكوز في الدم حول 200 ملغ / دل, ولكن يمكن أن تكون عالية مثل 400 ملغ / دل15. عندما يتم حث مستويات عالية من الإجهاد التأكسدي (OS) في أنسجة الجرح مباشرة بعد الجرح ، يصبح الجرحمزمنا 16. وتعتبر الجروح المزمنة لمدة 20 يوما ً وتبقى مفتوحة لمدة 60 يوماً أو أكثر. ويمكن رؤية Biofilm التي تنتجها البكتيريا النامية بداية ثلاثة أيام بعد الجرح. يمكن رؤية فيلم حيوي ناضج بعد 20 يوما من الإصابة ويستمر حتى إغلاق أي من الجرح. البكتيريا التي تشكل biofilm نجد في هذه الفئران وجدت أيضا في الجروح المزمنة السكري الإنسان.
يتم تحفيز الإجهاد التأكسدي عن طريق علاج الجروح مع اثنين من مثبطات الإنزيمات المضادة للأكسدة، كاتالاز والجلوتاثيون بيروكسيداز، وهما إنزيمان مع القدرة على كسر بيروكسيد الهيدروجين. بيروكسيد الهيدروجين هو نوع من الأكسجين التفاعلي ويمكن أن يسبب تلف الخلايا من خلال أكسدة البروتينات والدهون والحمض النووي. كاتالاز يحفز تحلل بيروكسيد الهيدروجين إلى مواد كيميائية أقل ضررا الأكسجين والماء. 3-أمينو-1,2,4-تريازول (ATZ) يمنع الكاتالاز عن طريق ربط على وجه التحديد وبشكل مشترك إلى المركز النشط للإنزيم، وتعطيله17،18،19. وقد استخدمت ATZ لدراسة آثار الإجهاد التأكسدي على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي من خلال تثبيط catalase20،21،22،23،24. الجلوتاثيون بيروكسيداز يحفز الحد من بيروكسيد الهيدروجين من خلال مضادات الأكسدة، الجلوتاثيون، وهو إنزيم مهم يحمي الخلية من الإجهاد التأكسدي25. حمض ميركابتوسوتشيك (MSA) يمنع الجلوتاثيون بيروكسيداز عن طريق ربط الموقع النشط سيلينوسيستين للإنزيم مع ثيول، وتعطيل ه26. وقد استخدمت MSA لدراسة آثار الإجهاد التأكسدي في المختبر وفي الجسم الحي وكذلك20،27،28.
هذا النموذج الجديد من الجروح المزمنة هو نموذج قوي للدراسة لأنه يشارك العديد من نفس الميزات التي لوحظت في الجروح المزمنة السكري البشري، بما في ذلك التهاب لفترات طويلة من زيادة نظام التشغيل وتشكيل biofilm الطبيعية من ميكروبيوم الجلد. وقد ضعفت الجروح التفاعل الجلدي والبشرة، وترسب المصفوفة غير الطبيعية، وضعف تكوين الأوعية الدموية والأوعية الدموية التالفة. سوف تتطور الجروح المزمنة في كل من الفئران الذكور والإناث، بحيث يمكن استخدام كلا الجنسين لدراسة الجروح المزمنة. ولذلك، فإن نموذج الجرح المزمن يمكن أن يسهم بشكل كبير في تعزيز الفهم الأساسي لكيفية بدء هذه الجروح. استخدام هذا النموذج الجروح المزمنة يمكن أن توفر إجابات على الأسئلة الأساسية حول كيفية بدء المزمنة / تحقيقها من خلال مساهمات من علم وظائف الأعضاء من ضعف التئام الجروح والميكروبيوم من المضيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
بمجرد إنشاء الجروح المزمنة على الفئران، يمكن استخدام النموذج لدراسة عمليات التئام الجروح المعاقة التي تنطوي عليها بداية المزمنة. ويمكن أيضا استخدام النموذج لاختبار فعالية مجموعة واسعة من المواد الكيميائية والأدوية التي يمكن أن تعكس تطور الجروح المزمنة وضعف الشفاء ويؤدي إلى إغلاق الجرو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وليس لدى أصحاب البلاغ أي اعتراف.
Materials
| B6.BKS(D)-Leprdb/J | The Jackson Laboratory | 00697 | Homozygotes and heterozygotes available |
| Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin | Nair | a chemical depilatory | |
| Buprenex (buprenorphine HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg/ml, Class 3 |
| 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) | TCI | A0432 | |
| Mercaptosuccinic acid (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | autoclave steriled | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Oxygen | Tank must be compatible with vaporizing system | ||
| Isoflurane vaporizer | JA Baulch & Associates | ||
| Wahl hair clipper | Wahl | Lithium Ion Pro | |
| Acu Punch 7mm skin biopsy punches | Acuderm Inc. | P750 | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Transparent film dressing (6 cm x 7 cm) |
| Heating pad | Conair | Moist Dry Heating Pad | |
| Insulin syringes | BD | 329461 | 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2") |
| 70% ethanol | |||
| Kimwipes | |||
| Tweezers | |||
| Sharp surgical scissors | |||
| Thin metal spatula | |||
| Tubing | |||
| Mouse nose cone | |||
| Gloves | |||
| small plastic containers |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
- Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
- MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
- Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
- Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
- Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
- Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
- Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
- Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
- Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , (2014).
- Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
- Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
- Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
- Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
- Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
- Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
- Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
- Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
- Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
- Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
- Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
- Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
- Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
- Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
- Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
- Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
- Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
- Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
- Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
- Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
- Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
- Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
- Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
- Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
- Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
- Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
- Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
- Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
- Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
- Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
- Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).
