Protokoll zur Herstellung chronischer Wunden bei diabetischen Mäusen

Summary

Chronische Wunden werden aus akuten Wunden auf einem diabetischen Mausmodell entwickelt, indem sie nach einer schweren Kutanwunde einen hohen Grad an oxidativem Stress induzieren. Die Wunde wird mit Inhibitoren für Katathase und Glutathionperoxidase behandelt, was zu einer beeinträchtigungen Heilung und Biofilmentwicklung durch Bakterien im Hautmikrobiom führt.

Abstract

Chronische Wunden entwickeln sich als Folge einer fehlerhaften Regulation in einem oder mehreren komplexen zellulären und molekularen Prozessen, die an der richtigen Heilung beteiligt sind. Sie wirken sich auf 6,5 Millionen US-Dollar aus und kosten allein in den USA 40 Milliarden US-Dollar pro Jahr. Obwohl erhebliche Anstrengungen unternommen wurden, um zu verstehen, wie sich chronische Wunden beim Menschen entwickeln, bleiben grundlegende Fragen unbeantwortet. Kürzlich haben wir ein neuartiges Mausmodell für diabetische chronische Wunden entwickelt, die viele Merkmale menschlicher chronischer Wunden aufweisen. Mit db/db^-/- Mäusen können wir chronische Wunden erzeugen, indem wir unmittelbar nach der Wundwunde hohe Konzentrationen von oxidativem Stress (OS) im Wundgewebe induzieren, wobei eine einmalige Behandlung mit Inhibitoren speziell für die antioxidativen Enzyme Catalase und Glutathionperoxidase. Diese Wunden haben ein hohes OS-Niveau, entwickeln Biofilm natürlich, werden innerhalb von 20 Tagen nach der Behandlung vollständig chronisch und können mehr als 60 Tage offen bleiben. Dieses neuartige Modell hat viele Merkmale diabetischer chronischer Wunden beim Menschen und kann daher wesentlich dazu beitragen, das grundlegende Verständnis davon zu fördern, wie Wunden chronisch werden. Dies ist ein großer Durchbruch, weil chronische Wunden beim Menschen erhebliche Schmerzen und Leiden für Patienten verursachen und zu einer Amputation führen, wenn sie ungelöst sind. Darüber hinaus sind diese Wunden sehr teuer und zeitaufwändig zu behandeln und führen zu erheblichen Einkommensverlusten für die Patienten. Fortschritte in diesem Studienbereich durch die Verwendung unseres chronischen Wundmodells können die Gesundheitsversorgung von Millionen von Menschen, die unter diesem schwächenden Zustand leiden, erheblich verbessern. In diesem Protokoll beschreiben wir ausführlich das Verfahren, um akute Wunden chronisch zu werden, was bisher nicht geschehen ist.

Introduction

Die Wundheilung umfasst komplexe zelluläre und molekulare Prozesse, die zeitlich und räumlich reguliert sind, in sequenziellen und überlappenden Stadien organisiert sind, die viele verschiedene Zelltypen umfassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Immunantwort und die Gefäße. System¹. Unmittelbar nachdem die Haut eine Verletzung erlitten hat, aggregieren sich Faktoren und Blutzellen zur Wundstelle und initiieren die Gerinnungskaskade zu einem Gerinnsel. Nachdem die Homöostase erreicht ist, glaudern die Blutgefäße, um Sauerstoff, Nährstoffe, Enzyme, Antikörper und chemotaktische Faktoren, die Polymorphonukleozyten zur Räumung des Wundbettes von fremdem Schutt reinigen und proteolytische Enzyme absondern, in die Wundstelle zu lassen. ². Aktivierte Blutplättchen sezernieren eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren, um die Keratinozyten an der Wundkante zu stimulieren, um den verwundeten Bereich neu zu epithelisieren. Monozyten, die an der Wundstelle rekrutiert werden, differenzieren sich in Makrophagen, die Phagozytosebakterien und tote Neutrophile phagozytosieren und zusätzliche Faktoren absondern, um keratinozyte proliferative und pro-wandernde Signale aufrechtzuerhalten. In der Proliferationsphase, während die Reepithelisierung anhält, setzt neues Granulationsgewebe, bestehend aus Fibroblasten, Monozyten/Makrophagen, Lymphozyten und Endothelzellen, den Wiederaufbauprozess fort². Die Angiogenese wird durch die Förderung der Endothelzellproliferation und -migration stimuliert, was zu einer neuen Gefäßentwicklung führt. Die Epithelisierung und Remodellierung der extrazellulären Matrix konstruieren eine Barriere gegen die Umwelt. Wenn sich die Wunde heilt und sich granulationsgewebe zu einer Narbe entwickelt, eliminiert Apoptose entzündliche Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen, ohne zusätzliche Gewebeschäden zu verursachen. Die Zugfestigkeit des Gewebes wird durch Fibroblasten verstärkt, die verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix wie Kollagen umbauen, so dass das neu gebildete Gewebe fast so stark und flexibel ist wie die unverwundete Haut².

Jede Abweichung von dieser stark abgestimmten Progression hin zum Wundverschluss führt zu beeinträchtigten und/oder chronischen Wunden³. Chronische Wunden sind gekennzeichnet durch erhöhten oxidativen Stress, chronische Entzündung, beschädigte Mikrovaskulatur und abnorme Kollagenmatrix in der Wunde⁴. Oxidativer Stress, insbesondere in derWunde, kann den Wundverschluss 2^,5verzögern. Wenn in der ersten Phase der Wundheilung die Entzündliche Phase unreguliert wird, geht das Wirtsgewebe aufgrund eines kontinuierlichen Zustroms von Entzündlichen Zellen^5, die zytotoxische Enzyme freisetzen, einer Zunahme freier Sauerstoffradikale und unregulierte Entzündungsmediatoren, die zum Zelltod^6,7führen.

In dieser zerstörerischen Mikroumgebung nutzen biofilmbildende Bakterien wirtsnährstoffe und tragen zur Schädigung des Wirtsgewebes^{bei 2}. Diese Biofilme sind schwer zu kontrollieren und zu entfernen, da die hydratisierten extrazellulären polymeren Substanzen, die aus Proteinen, DNA, RNA und Polysacchariden bestehen, es Bakterien, die im Inneren leben, ermöglichen, gegenüber konventionellen Antibiotikatherapien tolerant zu sein und sich der angeborene und adaptive Immunantwort des Wirts^2,8,9.

Das Studium chronischer Wunden ist von entscheidender Bedeutung, da sie 6,5 Millionen Us-Dollar betreffen und allein in den USA 40 Milliarden DOLLAR pro Jahr kosten¹⁰. Patienten mit Diabetes haben ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung chronischer Wunden, die einer Amputation bedürfen, um die Ausbreitung der Infektion einzudämmen. Diese Patienten haben ein Sterblichkeitsrisiko von 50 % innerhalb von 5 Jahren nach der Amputation, das dem Pathophysiologiemechanismus von Diabetes¹¹zugeschrieben wird. Die Beziehung zwischen dem Immunsystem des Wirts und dem Mikrobiom in der Wundheilung ist ein wichtiges Thema der laufenden Forschung, da die Folgen chronischer Wunden, wenn ungelöst, Amputation und Tod¹²umfassen.

Obwohl erhebliche Anstrengungen unternommen wurden, um zu verstehen, wie sich chronische Wunden beim Menschen entwickeln, ist es immer noch unklar, wie und warum sich chronische Wunden bilden. Experimente zur Untersuchung der Mechanismen der beeinträchtigungen Heilung sind beim Menschen schwierig durchzuführen, und Wundheilungsspezialisten sehen nur Patienten mit chronischen Wunden, die bereits seit Wochen bis Monaten die Chronik erreicht haben. So sind Spezialisten nicht in der Lage zu untersuchen, welche Prozesse schief gelaufen sind, die die Wunde zu entwickeln, um chronisch zu werden². Es fehlt an Tiermodellen, die die Komplexität menschlicher chronischer Wunden rekapitulieren. Bis zur Entwicklung unseres Modells gab es kein Modell für chronische Wundstudien.

Das chronische Wundmodell wurde bei Mäusen entwickelt, die eine Mutation im Leptinrezeptor haben (db/db^{-/-) 13}. Diese Mäuse sind fettleibig, diabetisch, und haben beeinträchtigte Heilung, aber entwickeln keine chronischen Wunden¹⁴. Der Blutzuckerspiegel liegt im Durchschnitt bei 200 mg/dL, kann aber bis zu 400 mg/dL¹⁵betragen. Wenn ein hoher oxidativer Stress (OS) im Wundgewebe unmittelbar nach der Wundverwundung induziert wird, wird die Wunde chronisch¹⁶. Die db/db^-/- Wunden gelten von 20 Tagen als chronisch und bleiben 60 Tage oder mehr geöffnet. Biofilm, der von Bakterien produziert wird, entwickelt sich ab drei Tagen nach der Verwundung; ein ausgereifter Biofilm ist 20 Tage nach der Verwundung zu sehen und besteht bis zum Wundenverschluss. Die biofilmbildenden Bakterien, die wir in diesen Mäusen finden, finden sich auch in menschlichen diabetischen chronischen Wunden.

Oxidativer Stress wird induziert, indem die Wunden mit zwei Inhibitoren antioxidativer Enzyme, Kataalase und Glutathionperoxidase, zwei Enzymen mit der Fähigkeit, Wasserstoffperoxid abzubauen, behandelt werden. Wasserstoffperoxid ist eine reaktive Sauerstoffspezies und kann durch die Oxidation von Proteinen, Lipiden und DNA zelluläre Schäden verursachen. Kataase katalysiert die Zersetzung von Wasserstoffperoxid in weniger schädliche Chemikalien Sauerstoff und Wasser. 3-Amino-1,2,4-Triazol (ATZ) hemmt die Kataalase durch spezifische und kovalente Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms und inaktiviert es^17,18,19. ATZ wurde verwendet, um die Auswirkungen von oxidativem Stress sowohl in vitro als auch in vivo durch die Hemmung der Kataalase^{20,21,22,23,24}zu untersuchen. Glutathionperoxidase katalysiert die Reduktion von Wasserstoffperoxid durch das Antioxidans Glutathion und ist ein wichtiges Enzym, das die Zelle vor oxidativem Stress schützt²⁵. Mercaptosuccinsäure (MSA) hemmt Glutathionperoxidase durch Bindung an die Selenocystein-aktive Stelle des Enzyms mit Thiol, inaktiviert es²⁶. MSA wurde verwendet, um die Auswirkungen von oxidativem Stress in vitro und in vivo sowie^20,27,28zu untersuchen.

Dieses neuartige Modell chronischer Wunden ist ein mächtiges Modell zu studieren, weil es viele der gleichen Merkmale in menschlichen diabetischen chronischen Wunden beobachtet teilt, einschließlich längerer Entzündung entzeln von erhöhten OS und natürliche Biofilmbildung aus Hautmikrobiom. Die Wunden haben eine beeinträchtigte dermal-epidermale Wechselwirkung, abnormale Matrixablagerung, schlechte Angiogenese und beschädigte Vaskulatur. Chronische Wunden entwickeln sich sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen, so dass beide Geschlechter verwendet werden können, um chronische Wunden zu untersuchen. Daher kann das chronische Wundmodell wesentlich dazu beitragen, das grundlegende Verständnis dessen, wie solche Wunden beginnen, zu fördern. Mit diesem chronischen Wundmodell können Antworten auf grundlegende Fragen darüber gegeben werden, wie Die Chronik durch Beiträge aus der Physiologie der beeinträchtigten Wundheilung und dem Mikrobiom des Wirts initiiert/erreicht wird.

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Bundesbestimmungen und der Politik der University of California und Verfahren abgeschlossen und wurden von der University of California, Riverside IACUC genehmigt. 1. Tier Verwenden Sie diabetische und fettleibige B6. BKS(D)-Leprdb/J Mäuse für das chronische Wundmodell. Kaufoptionen umfassen entweder Heterozygoten für die Zucht oder Homozygoten direkt für Experimente. Züchte nasch heterozygote Män…

Representative Results

Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für eine Wunde ohne Behandlung von Inhibitoren, die sich in Richtung Wundverschluss bewegen, und eine Wunde mit der Behandlung von Inhibitoren, die in Richtung Chronik voranschreiten. Der transparente Verband wurde auf der chronischen Wunde belassen, so dass Biofilm und Flüssigkeitsansammlung sichtbar sind. Chronische Wundinitiation findet in weniger als 6 Stunden st…

Discussion

Sobald chronische Wunden an den Mäusen entstehen, kann das Modell verwendet werden, um beeinträchtigte Wundheilungsprozesse zu untersuchen, die an der Initiierung der Chronik beteiligt sind. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit einer breiten Palette von Chemikalien und Medikamenten zu testen, die chronische Wundentwicklung und beeinträchtigungsende Heilung umkehren und zu Wundverschluss und Heilung führen können. Es können verschiedene Zeitpunkte nach Beginn der Chronik untersucht werden: z…

Materials

B6.BKS(D)-Leprdb/J	The Jackson Laboratory	00697	Homozygotes and heterozygotes available
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin	Nair		a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl)	Henry Stein Animal Health	059122	0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)	TCI	A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA)	Aldrich	88460
Phosphate buffer solution (PBS)			autoclave steriled
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	029405	NDC 11695-6776-2
Oxygen			Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer	JA Baulch & Associates
Wahl hair clipper	Wahl		Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches	Acuderm Inc.	P750
Tegaderm	3M	Ref: 1624W	Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad	Conair		Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes	BD	329461	0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers