熱ナノイン プリント技術とヒトの内皮細胞コロニー形成細胞の応答のスクリーニングによるグラデーションによるナノパターンの作製
Summary
ここでは、グラデーションによるナノパターン板の熱ナノイン プリントの創製とナノ構造に対するひと血管内皮前駆細胞の反応のスクリーニング方法のためのプロトコルを提案する.記述されている技術を使用して、物理的な刺激によって細胞の挙動を操作できる足場を生成することが可能です。
Abstract
ナノトポグラフィ様々 な細胞外マトリックス (Ecm) ボディのまわりで見つけることができ、細胞内反応に重要な規制措置を持っている知られています。しかし、ナノ構造のサイズと適切なスクリーニング ツールの不足のため細胞の応答との関係を決定することは困難です。ここでは、細胞応答の操作の再現性とコスト効果の高いグラデーションによるナノパターン板の開発を示します。熱インプリント法により作製したマスター金型、増加の直径範囲 [120-200 nm (GP 120/200)、200-280 nm (GP 200/280) 280-360 nm (GP 280/360)] のナノピラー グラデーションによるナノパターン板とアルミニウムの陽極酸化 (AAO) を使用して.これらのグラデーションによるナノパターン プレート ECM におけるナノトポグラフィの様々 なサイズを模倣するように設計されていた、画面のひと内皮細胞コロニー形成細胞 (hECFCs) の反応に使われました。このプロトコルでセル工学, ひと末梢血から hECFCs を育成、養殖によるナノパターン プレートに hECFCs のテクニックのグラデーションによるナノパターン プレートの加工手順をについて説明します。
Introduction
最近では、表面形状の物理的な刺激による細胞の応答細胞工学1,2,3,4の分野で脚光を浴びています。したがって、セル添付ファイル表面5三次元ナノ構造のより多くの注意が注目されています。それはセルの表面認識装置であるインテグリンが機械伝達6を通じて ECM のナノ ・ マイクロ構造による物理的な刺激を送信することが報告されています。この機械的刺激からお問い合わせガイダンス7セルの動作を調整してストレスファイバーと細胞8の剛性に加え、形状を変更する細胞骨格の再編を誘導します。
体内のひと血管内皮前駆細胞 (hEPCs) は、密接に周囲の ECM9の微小環境と対話します。これは剪断応力に由来する血流10限り、ECM の物理的な状態が特定の細胞-マトリックス接着複合体形成のための重要なパラメーターとして機能するということを示します。それが報告されて表面ナノトポグラフィ強化 hEPCs11の大規模なキャピラリー管ネットワークの体外形成システムを ECM/バイオ可溶性因子に結合機能不全基板を認識する hEPCs を有効にし、促進します。癒しの12,13を傷つけます。それにもかかわらず、ECM と hEPCs との関係は明確に理解されていません。
多くの研究者が細胞の応答と異なる基板14,15,16からの物理的な手がかりとの関係を明らかにするしようとすると、これらの研究をナノ構造体の固定サイズのみ使用またはnanopatterns ナノ構造および細胞の行動のサイズ間の関係を明らかにする制限がある不規則な手配をします。ここでの問題は、ナノ構造の最適なサイズを見つけること既存の退屈で反復的なアプローチを置き換えることができます細胞をスクリーニングするための適切なツールの欠如です。したがって、簡単な手法は、繰返しのない物理的な刺激の細胞反応をスクリーニングするため必要です。
ここでは、グラデーションによるナノパターン配列ナノピラーの直径が徐々 に増加を生産する私たち以前レポート17,18,の19で使用される方法をについて説明します。さらに、育成およびグラデーションによるナノパターン プレート細胞に物理的な刺激の効果を決定するための hECFCs の動作を分析する方法も記載されています。軽度の陽極酸化、漸進的なエッチングとスティッ キング防止層コーティング法は、グラデーションの AAO 金型を作製する使用されました。熱リソグラフィー技術を刷り込みを採用し、同じポリスチレン グラデーション nanopatterns は低コストで安易な方法で作り出されました。グラデーションの nanopatterns を使用して、ナノ構造体のサイズは、実験の 1 つのセットのセルの動作に大きな影響を判断することは不可能です。我々 は、このグラデーションによるナノパターンが血液由来の hECFC または他の細胞とナノ構造の様々 なサイズの間相互作用メカニズムを理解する上で役立つことを期待します。
Protocol
Representative Results
Discussion
しばしば AAO の作製は亀裂などと書き込み、毛穴の不規則な形状の欠陥に苦しみます。これらの欠陥の主な理由は、陽極酸化される金属基板の性質と電解質21の抵抗によって強く影響を受ける電解のブレーク ダウンと呼ばれます。電解質の抵抗はその温度により異なります、電極から連続的に熱を排除する高電圧陽極酸化条件で安定した電解質の位置の温度を維持するため?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事は基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 文部省、科学および技術 (MEST) [NRF 2015R1D1A1A01060397] バイオ ・医療技術開発によって資金を供給に支えられ科学省 ICT ・将来計画 [NRF 2017M3A9C6029563] によって資金を供給された NRF のプログラムです。
Materials
| Perchloric acid 60% | Daejung Chemicals & Metals | 6512-4100 | |
| Ethyl alcohol, absolute 99.9% | Daejung Chemicals & Metals | 4118-4100 | |
| Phosphoric acid 85% | Daejung Chemicals & Metals | 6532-4400 | |
| Methyl alcohol 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 5558-4400 | |
| Chromium(VI) oxide | Daejung Chemicals & Metals | 2558-4400 | |
| Sulfuric acid 95% | Daejung Chemicals & Metals | 7781-4100 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Daejung Chemicals & Metals | 4104-4400 | |
| n-hexane 95% | Daejung Chemicals & Metals | 4081-4400 | |
| Toluene 99.5% | Daejung Chemicals & Metals | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecyl)dimethylchlorosilane | Gelest | SIH5840.4 | Moisture sensitive |
| Methoxynonafluorobutane 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Collagen solution | Stemcell | #4902 | |
| Gelatin | Sigma aldrich | G1890 | Protein coating solution |
| Ficoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrophilic polysaccharide solution |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Endothelial cell expansion medium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010031 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyde | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehyde | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Osmium tetroxide | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Octylphenol ethoxylate |
| Goat serum | Gibco | 26050-088 | |
| anti-human vinculin primary antibody | Sigma aldrich | V9131 | |
| F-actin probe | Molecular Probes | A12379 | Fluorescence-conjugated phalloidin |
| Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A11001 | Fluorescence-conjugated secondary antibody |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma aldrich | D9542 | |
| Mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Anti-human vWF primary antibody | DAKO | A0082 | |
| Anti-human CD144 primary antibody | BD Biosciences | #555661 | |
| Eponate 12™ Embedding Kit, with BDMA | Ted Pella | 18012 | Epoxy resin |
| Uranyl Acetate, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Lead Citrate, Trihydrate, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra pure aluminum plate | Goodfellow | 26050-088 | |
| Polystyrene sheet | Goodfellow | ST313120 | |
| 8.0" silicon wafer | Siltron | 29-01024-03 | Single side polished, 725 µm thick |
| Vacuum desiccator, 4.4 L | Kartell | KA.230 | |
| Vacuum pump | Vacuumer | V3.VOP100 | |
| Power supply | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Magnetic stirrer | Daihan scientific | SL.SMS03022 | |
| Overhead stirrer | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulator | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Linear moving stage | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Angle bracket, 90 degrees | Zaber | AB90M | Accessory of the linear moving stage |
| PMP forcep, 145 mm | Vitlab | 67995 | Nonmetallic tweezer |
| PTFE beaker, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson | B2510MTH | |
| PCB cutter | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Nanoimprint device | Nanonex | NX-2000 | |
| Oxygen plasma generator | Femto Science | CUTE | |
| Low temperature sterilizer | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Scanning electron microscope | JEOL | JSM6701 | |
| Transmission electron microscope | Hitachi | H-7500 |
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