Dette arbeidet viser potensialet i trykte glycan matrise (PGA) teknologi for analyse av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer i liten dyrene.
Repertoaret av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer av en gitt person er ofte forbundet med statusen immunologiske. Ikke bare den personlige immun tilstanden avgjør suksessen bekjempe interne og eksterne potensielle trusselen signaler, men også eksistensen av et bestemt mønster av sirkulerende anti-glycan antistoffer (og deres serologisk nivå variasjon) kan være en betydelig markør utbruddet og progresjon av visse patologiske forhold. Her beskriver vi en trykt Glycan matrise PGA-basert metode som tilbyr muligheten til å måle hundrevis av glycan mål med svært høy følsomhet; med en minimal mengde utvalget, en vanlig begrensning når liten dyrene (rotter, mus, hamster, etc.) er brukt som modeller adresse aspekter av menneskelige sykdommer. Som et representativt eksempel på denne tilnærmingen viser vi resultatene fra analysen av repertoaret av naturlig anti-glycan antistoffer i BALB/c mus. Viser vi at hver BALB/c musen involvert i studien, til tross for å være genetisk identisk og vedlikeholdt under like forhold, utvikler et bestemt mønster av naturlig anti-karbohydrater antistoffer. Dette arbeidet hevder å utvide bruken av PGA teknologien å undersøke repertoar (særegenheter) og nivåer av sirkulerende anti-karbohydrater antistoffer, både i helse og under en patologisk tilstand.
Antistoffer spille en sentral rolle i vårt forsvar mot invaderende patogener ved å nøytralisere direkte virus1,2 og bakterier2,3, ved å aktivere komplement systemet4,5 og styrking av fagocytose6. I tillegg er de grunnleggende elementene i kreft målretting og eliminering av ondartede celler7og homeostase vedlikehold8,9.
Lidelser av immunsystemet kan føre til autoimmune og inflammatoriske sykdommer10 og kreft11. Alle disse pathological betingelser krever ideelt en rask diagnose for en effektiv behandling. Ved autoimmune sykdommer er serologisk tilstedeværelsen av autoantistoffer i de fleste tilfeller en prediktor for diagnose av autoimmunitet10,12. Disse antistoffene reagere med celleoverflaten ekstracellulære autoantigens, og de er ofte tilstede i mange år før presentasjonen av autoimmune sykdommer10,12. Immun mankoen og kreft er også diagnostisert med blodprøver at enten måle nivået av immun elementer som antistoffer eller deres funksjonelle aktiviteten11.
Identifikasjon av repertoaret av sirkulerende antistoffer og serologisk nivåene er viktig å angi en prognose og evaluere utviklingen av alle nevnte pathological betingelser. Vi har tidligere vist potensialet i PGA teknikk for analyse av sirkulerende antistoffer i forskjellige dyrearter13–16, minimere bruken av store mengder serologisk prøver, unngå problemet forbundet med antistoffer kryssreaktivitet17 og tillater høy gjennomstrømming profilering av en omfattende repertoar av antistoffer15.
Glycan-baserte immunanalyser er hovedsakelig betinget, blant andre faktorer, opprinnelse og produksjon av karbohydrater, som bestemmer affinitet og bindende ligander15,18,19,20 ,21. Glycan-basert immunanalyser kan utvikles i suspensjon (mikrosfærer)15,21,22 eller flat-aktivert overflater15,21,22, 23,24. Sist inkluderer ELISA (den mest konvensjonelle disse metodene) og PGA. Det er ikke mye data sammenligne disse metoder i de samme eksperimentelle innstilling15,25,26,27. Vi har tidligere sammenlignet effekten og selektivitet av disse immunanalyser til profil anti-glycan antistoffer i individuelle humant plasma prøver15. For noen antistoffer som de rettet mot anti-A/B-blodtype, alle immunanalyser finner dem med statistisk signifikans og de korrelert positivt med hverandre15,18,21. I mellomtiden anti-P1 antistoffer ble hovedsakelig oppdaget av PGA med høyeste discriminative makt, og det var ingen sammenheng i bestemmelser laget av forskjellige glycan-baserte immunanalyser15,18, 21. disse forskjellene mellom metoder var hovedsakelig knyttet til antistoff/antigen forhold og glycan orientering15. ELISA og hjuloppheng matriser er mer utsatt for uspesifikke bindende enn PGA fordi det er et overskudd av antigen over antistoffer i disse metodene15. Dessuten er retningen på glykaner i PGA mer begrenset enn i ELISA og hjuloppheng matriser15. ELISA er praktisk når studien inkluderer en begrenset panel av glykaner. Suspensjon matriser tilbyr ELISA større fleksibilitet når det gjelder analysen rekonfigurering. PGA er svært praktisk for oppdagelsen tilnærminger15,18,21,28. Til tross for disse klare fordeler og ulemper, kan de tre nevnte immunanalyser brukes til å studere ulike aspekter av glycan-antistoff interaksjoner. Det endelige målet av studien er en guide utvalget av mer egnet metodikken.
I dag fungerer som mål å utvide bruken av PGA teknologi for analyse av repertoaret av sirkulerende anti-glycan antistoffer i liten dyrene. Resultatet representant presenterer vi her en detaljert protokoll for å vurdere repertoaret av naturlig anti-karbohydrater antistoffer i voksen BALB/c mus av PGA.
Glycan microarrays har blitt uunnværlig verktøy for å studere protein-glycan vekselsvirkningene40. Dette arbeidet beskriver en protokoll basert på PGA teknologi å studere repertoaret av sirkulerende av anti-karbohydrater antistoffer i BALB/c mus. Siden PGA tilbyr muligheten for skjermen av biologisk ukjent glykaner, er det en svært praktisk oppdagelsen verktøyet13,15,28. Den foreslåtte metoden til…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av “Fondo de Investigaciones Sanitarias” (FIS) gi PI13/01098 fra Carlos III Health Institute, spanske Helsedepartementet. DB-G var godt fra en post-doc forskning finansiert av EU syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under Grant avtalen 603049 (TRANSLINK). NK, NS, og NB ble støttet av tildeling #14-50-00131 av russisk Science Foundation. DB-G ønsker å uttrykke sin takknemlighet Marta Broto, J. Pablo Salvador og Ana Sanchis for utmerket kundestøtte og Alexander Rakitko hjelp med statistisk analyse. Med støtte fra den “Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d’Universitats jeg Recerca del Departament d’Empresa jeg Coneixement de la Generalitat de Catalunya (gi nummer 2018 DI 021). Vi takker hjerter program / Generalitat de Catalunya for institusjonelle støtte.
Antibodies | |||
biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
Equipment | |||
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
Biological samples | |||
BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
Chemicals, Reagents and Glycans | |||
Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
Materials | |||
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
Software and algorithms | |||
ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
kinelmer.com/microarray | |||
Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ |