JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Published: May 03, 2018
doi:
10.3791/57674
, , ,
1Department of Chemistry,State University of New York at Binghamton

Summary

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Abstract

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) is een meester-controller voor de celcyclus in alle eukaryoten en kinaseenzym van naar schatting 8-13% van de Proteoom; het aantal vastgestelde doelstellingen voor Cdk1, met name in menselijke cellen is echter nog steeds laag. De identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites is belangrijk, aangezien zij mechanistische inzicht verwerven in hoe Cdk1 de celcyclus controleert. Celcyclus verordening is essentieel voor trouwe chromosoom segregatie en gebreken in dit ingewikkelde proces leiden tot chromosoomafwijkingen en kanker.

Hier beschrijven we een in vitro kinase test die wordt gebruikt voor het identificeren van Cdk1-specifieke fosforylatie sites. In deze test, is een gezuiverde eiwit gefosforyleerd in vitro door commercieel beschikbare menselijke Cdk1/cycline B. Successful fosforylatie wordt bevestigd door SDS-PAGE en fosforylering sites worden vervolgens geïdentificeerd door massaspectrometrie. Ook beschrijven we zuivering protocollen die opbrengst zeer zuiver en homogene eiwit preparaten geschikt voor de kinase-bepaling en een bindende bepaling voor de functionele verificatie van de geïdentificeerde fosforylatie sites, die de interactie tussen probes een klassieke nucleaire localisatie signaal (cNLS) en haar nucleair vervoer receptor karyopherin α. Om te helpen met de proefopzet, bekijken we methoden voor de voorspelling van Cdk1-specifieke fosforylatie sites uit proteïne sequenties. Deze protocollen presenteren samen een zeer krachtige aanpak waarmee de opbrengsten Cdk1-specifieke fosforylatie sites en kunnen mechanistisch onderzoek naar hoe Cdk1 de celcyclus controleert. Aangezien deze methode is gebaseerd op zuivere eiwitten, kan het worden toegepast op elk organisme en opbrengsten betrouwbaar modelresultaten, vooral wanneer gecombineerd met functionele studies van de cel.

Introduction

Kinases zijn enzymen die overdracht van fosfaat groepen van ATP op substraten en veel cellulaire processen regelen. Deze fosforylatie is omkeerbaar, snel, voegt twee negatieve ladingen, vrije energie worden opgeslagen en is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties gebruikt door cellen. Cdk1, die ook bekend staat als celdeling cyclus eiwit 2 homolog (cdc2) is een meester-controller voor de celcyclus in alle eukaryoten1,2,3,4,5, en kinaseenzym een naar schatting 8-13% van de Proteoom6,7.

Terwijl recente proteomic studies dat veel fosforylatie plaatsen in eiwitten, in de meeste gevallen gebleken is de kinase verantwoordelijk voor deze wijzigingen onbekend. Het aantal bekende Cdk1 doelen, met name in menselijke cellen is laag7. De identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites is belangrijk, omdat hierdoor mechanistische studies die stellen hoe Cdk1 controleert de celcyclus. Celcyclus-verordening is belangrijk voor trouwe chromosoom segregatie en celdeling, en een groot aantal cellulaire processen moeten optreden ter ondersteuning van deze belangrijke fysiologische functie. Dit omvat stoppen transcriptie en vertaling vóór het begin van de mitose, evenals een dramatische reorganisatie in cellulaire structuur en organisatie, zoals de demontage van de nucleaire envelop chromosoom condensatie en de mitotische spindel vergadering. Deregulering en fouten in deze processen veroorzaken kanker, aangeboren afwijkingen of mitotische celdood. Specifieke remmers van Cdk1 zoals RO-3306 waren ontwikkelde8, die bieden krachtige hulpprogramma’s voor functionele studies, en sommige van deze remmers zijn momenteel in klinische proeven voor de behandeling van kanker (Zie9 voor beoordeling).

Hier beschrijven we een in vitro kinase bepaling die het mogelijk de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites maakt. In deze test, wordt commercieel beschikbare menselijke Cdk1/cycline B gebruikt om een gezuiverde doel eiwit in vitrophosphorylate. Fosforylering van een substraat verhoogt zijn massa en voegt twee negatieve ladingen; Dus, succesvol fosforylatie wordt bevestigd door een opwaartse verschuiving van de band van de gel eiwit op SDS-pagina. Cdk1-specifieke fosforylatie sites worden vervolgens geïdentificeerd door analyse van de Spectrometrie van de massa van het eiwit in vitro phosphorylated. Steun met experimenteel design, bekijken we ook computerhulpmiddelen en referenties voor de voorspelling van Cdk1-specifieke fosforylatie sites van de eiwit-reeks. Daarnaast beschrijven we ook zuivering protocollen die zeer zuiver en homogene eiwit preparaten geschikt voor de kinase assay opleveren. Tot slot, de geïdentificeerde fosforylatie sites moeten worden gecontroleerd door functionele studies, en een eenvoudige bindende test wordt hier beschreven voor dat doel. Gecombineerd, is dit een zeer krachtige aanpak waarmee de opbrengsten Cdk1-specifieke fosforylatie sites en kunnen mechanistisch onderzoek naar hoe Cdk1 de celcyclus7,10,11 controleert. Aangezien deze methode is gebaseerd op zuivere eiwitten, kan het worden toegepast op elk model organisme en opbrengsten betrouwbare resultaten. Functionele controle van de verkregen fosforylatie sites in vitro wordt echter aanbevolen, zoals cellen extra regulerende mechanismen, zoals posttranslationele modificaties, interactie partners of cellulaire lokalisatie op plek hebben die fosforylering sites kan toegankelijk of ontoegankelijk voor erkenning door Cdk1 maken.

Cdk1 herkent een consensus fosforylatie site die uit (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), bestaat waarbij X een residu en een serine of threonine de site van fosforylering is. Vooral belangrijk voor erkenning is de aanwezigheid van de proline in de + 1 positie. Bovendien, fundamentele residuen in de + 2 of + 3 posities zijn voorkeur, met de meeste Cdk1-specifieke fosforylatie sites met een Lys of Arg op de + 3 positie6,12.

Activering van Cdk1 strak geregeld is en leidt tot het begin van de mitose1,2,3,4,5. De activiteit van cycline-afhankelijk kinases is in het algemeen afhankelijk van hun associatie met verschillende cyclinen (cycline A, B, C, D en E bij de mens), die op het niveau van de celcyclus13oscillerende zijn uitgedrukt. Cdk1 expressie is constant over de celcyclus en de regulering van de activiteit is afhankelijk van zijn associatie met de regelgevende subeenheden A cycline en cycline B5,13,14,15, als goed als posttranslationele modificaties. Vorming van het B-complex met Cdk1/cycline is vereist voor de kinase activation5,14,15,16,17,18. In de G2-fase, is cycline B vertaald in het cytosol en geïmporteerd in de kern waar het bindt aan de Cdk15,14,15,16,17,18; echter de Cdk1/cycline B geïnactiveerd door fosforylering op residuen van Thr14 en Tyr15 door de menselijke Cdk1-remmende kinases Myt1 (membraan-geassocieerde tyrosine – en threonine-specifieke cdc2-remmende kinase) en Wee1, respectievelijk19, wordt gehouden 20,21. In de late fase van de G2, defosforylerings van Thr14 en Tyr15 door celdeling cyclus 25 fosfatase (cdc25) het kinaseactiviteit van de Cdk1/cycline B complex activeert en triggers van de initiatie van mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. phosphorylation van Thr161 is ook vereist voor Cdk1/cycline B activering en wordt gemedieerd door Cdk7, de Cdk-activeren kinase (CAK)18. Afbraak van cycline B in anafase inactiveert Cdk1, zodat de uitgang van mitose24,25. Activering van Cdk1/cycline B is dus een ingewikkeld proces. Het protocol hier gepresenteerd wordt uitgevoerd met verkrijgbare Cdk1/cycline B. Tijdens de recombinante uitdrukking van dit complex in insect cellen, het is geactiveerd in vivo door endogene kinases14,20 en blijft actief in de gezuiverde staat. De resulterende actief, recombinante menselijke Cdk1/cycline B is geschikt voor in vitro kinase testen.

Hier beschrijven we een protocol voor de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites in de menselijke centromeer eiwit F (RETOREN-F)10. RETOREN-F is een kinetochoor eiwit dat zich bevindt in de kern gedurende het grootste deel van de interfase (G1 en S-fase) en wordt geëxporteerd naar het cytosol in de G2 fase26,27,28 in een Cdk1-afhankelijke wijze10, 11. nucleaire localisatie wordt verleend door een bipartiete cNLS26. cNLSs worden herkend door de nucleaire vervoer factor karyopherin α, dat, samen met karyopherin β en RanGDP, de invoer van cNLS-cargo in de nucleus29 vergemakkelijkt. Nucleaire export in de G2-fase wordt bevorderd via een onbekende export traject10. Zodra RETOREN-F in het cytosol woont, het wordt gerekruteerd om de nucleaire envelop en op zijn beurt werft de motor eiwit complex dynein30,31. Dit traject is belangrijk om de positie van de respectieve aan de centrosoom kern tijdens de eerste stadia van de mitotische spindel vergadering in een dynein-afhankelijke manier, dat belangrijk voor de juiste timing van de mitotische ingang en voor een fundamentele proces in de hersenen is ontwikkeling30,31,32. Beginnend in de G2-fase, is RETOREN-F ook samengevoegd tot de kinetochoor waar het heeft een belangrijke rol voor trouwe chromosoom segregatie27,28,33,34,35 . Een belangrijke regelgevende stap van deze trajecten is de nucleaire export van RETOREN-F in de G2-fase, die afhankelijk is van Cdk110,11. We beschrijven hier een protocol voor de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites in de cNLS van RETOREN-F. Phosphomimetic mutaties van deze sites is vertragen van nucleaire invoer van RETOREN-F, suggereren dat Cdk1/cycline B direct cellulaire lokalisatie van RETOREN-F door fosforylering van de cNLS10regelt.

Globaal, dit kinase in vitro assay maakt het mogelijk de identificatie van specifieke substraten voor de kinase Cdk1. Purified doel eiwitten gefosforyleerd in vitro door de verkrijgbare Cdk1/cycline B-complex en de fosforylatie sites zijn vervolgens worden geïdentificeerd door de Spectrometrie van de massa. De identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites ondersteunt mechanistische studies die onthullen hoe Cdk1 controleert de celcyclus.

Protocol

1. de voorspelling van fosforylering van de Cdk1-specifieke Sites van de eiwit-volgorde Voordat u begint de kinase-bepaling, de volgorde van de eiwitten voor voorspelde Cdk1-specifieke fosforylatie sites analyseren en de literatuur voor experimenteel gevestigde fosforylatie sites zoeken met onbekende kinase specificiteit. Gebruik de volgende hulpmiddelen, databases en verwijzingen die worden samengevat. De BGA 3.0 software36,37 (http://gps.biocu…

Representative Results

We hebben onlangs een in vitro kinase assay (Figuur 1) gebruikt ter identificatie van de Cdk1-specifieke fosforylatie sites in een fragment van de RETOREN-F die deel uitmaakt van een cNLS10. Dit signaal verleent nucleaire localisatie van RETOREN-F gedurende het grootste deel van de interfase. In de G2-fase, wordt RETOREN-F geëxporteerd van de kern naar het cytosol in een Cdk1-afhankelijke manier. Met het oog op een mechanisti…

Discussion

Onze kinase in vitro assay is een zeer krachtige methode om het identificeren van moleculaire targets voor de kinase Cdk1, die een hoofdbesturing van de celcyclus en regelt veel belangrijke cellulaire processen. De methode wordt bepaald of een gezuiverde proteïne een substraat voor Cdk1 is en identificatie van specifieke fosforylatie sites kunt. Dit vergemakkelijkt het mechanistische studies voor de regulatie van cellulaire processen door fosforylering via Cdk1.

De meest kritische fa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California in Berkeley voor spectrometrische analyse en nuttige opmerkingen. Wij danken Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, instituten voor biologische wetenschappen, Chinese Academie van Wetenschappen, Shanghai, China voor het verstrekken van een full-length RETOREN-F-constructie. Tot slot bedanken wij Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan en Dr. Christof Grewer aan de Binghamton University voor toegang tot apparatuur. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Research Foundation voor de State University of New York en het departement chemie, State University of New York at Binghamton.

Materials

2800 ml baffled Fernbach flask Corning 44232XL
ampicillin Gold Biotechnology A-301-25
ATP Fisher Scientfiic BP413-25
benzamidine hydrochloride Millipore Sigma B6506-25
bottletop filter Corning 431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL New England Biolabs P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source) EMD Millipore 14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source) Invitrogen PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer New England Biolabs P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor Thermo Scientific 10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes EMD Millipore UFC900324
chlorampenicol Gold Biotechnology C-105-100
D/L methionine Agros Organics / Fisher 125650010
desalting pipet tips: Zip tips Millipore Sigma ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm Biorad 7321010
dithiothreitol Gold Biotechnology DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain EMD Millipore 71403
electrospray ionization Fourier transform ion Bruker Amazon Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer Bruker Amazon custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy Thermo Scientific 97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC GE Healthcare 29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
glutathione agarose Pierce 16101
glutathione, reduced Millipore Sigma G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker Infors I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Gold Biotechnology I2481C50
kanamycin Gold Biotechnology K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid Available upon request.
Luria Bertani medium Fisher Scientfiic BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated Eppendorf 5401000013
microtubes (0.5 ml) Eppendorf 30121023
microtubes (1.5 ml) Eppendorf 30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel Millipore Sigma P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid Millipore Sigma GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride Gold Biotechnology P470-10
PS protease: PreScission protease GE Healthcare 27084301
Phos-tag acrylamide Wako Pure Chem. Ind. 304-93521
reduced gluthathione Millipore Sigma G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) Fisher Scientfiic 055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning Agilent 210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier Branson 15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) Spectrum Labs 08 670B
swing out rotor TX-1000 Thermo Scientific 10033-778
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
  2. Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31 (1987).
  3. Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85 (9), 3009-3013 (1988).
  4. Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54 (3), 433-439 (1988).
  5. Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60 (3), 487-494 (1990).
  6. Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425 (6960), 859-864 (2003).
  7. Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2448-2461 (2016).
  8. Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  9. Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22 (7), 2159-2164 (2016).
  10. Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16 (15), 1414-1429 (2017).
  11. Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33 (6), 703-716 (2015).
  12. Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4 (11), 973-982 (1994).
  13. Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15 (6), 122 (2014).
  14. Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12 (5), 1947-1954 (1993).
  15. Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7 (7), 903-916 (1996).
  16. Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13 (16), 3772-3781 (1994).
  17. Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131 (1995).
  18. Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -. E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25 (6), 839-850 (2007).
  19. Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92 (21), 9638-9642 (1995).
  20. Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13 (3), 1675-1685 (1993).
  21. Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17 (2), 571-583 (1997).
  22. McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12 (1), 75-85 (1993).
  23. Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242 (1991).
  24. Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786 (1), 49-59 (2008).
  25. Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119 (12), 2401-2404 (2006).
  26. Zhu, X., Chang, K. -. H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -. H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270 (33), 19545-19550 (1995).
  27. Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130 (3), 507-518 (1995).
  28. Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26 (3), 214-226 (1993).
  29. Christie, M., Chang, C. -. W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428 (10A), 2060-2090 (2016).
  30. Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
  31. Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192 (5), 855-871 (2011).
  32. Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154 (6), 1300-1313 (2013).
  33. Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17 (13), 1173-1179 (2007).
  34. Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13 (4), 275-283 (2003).
  35. Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25 (10), 4062-4074 (2005).
  36. Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1598-1608 (2008).
  37. Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11 (10), 1070-1083 (2012).
  38. UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D158-D169 (2017).
  39. Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3 (104), ra3 (2010).
  40. Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105 (31), 10762-10767 (2008).
  41. Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69 (12), 2495-2505 (2013).
  42. Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279 (20), 20613-20621 (2004).
  43. Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10171-10176 (2009).
  44. McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 591-602 (2001).
  45. Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62 (13), 1284-1295 (1990).
  46. Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281 (33), 23545-23556 (2006).
  47. Hong, K. U., Kim, H. -. J., Kim, H. -. S., Seong, Y. -. S., Hong, K. -. M., Bae, C. -. D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284 (24), 16501-16512 (2009).
  48. Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88 (1999).
  49. Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  50. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  51. Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (18), 2075-2081 (2003).
  52. Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43 (2), (2017).
  53. Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7 (22), 3556-3563 (2008).
  54. Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (3), 608-613 (2006).
  55. Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276 (24), 20913-20923 (2001).
  56. Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274 (46), 32631-32637 (1999).

Tags

CDK1PhosphorylationKinase AssayCell CycleCENP-FProtein ExpressionE. ColiLB MediumAntibioticsProtein Purification
check_url/kr/57674?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay. J. Vis. Exp. (135), e57674, doi:10.3791/57674 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image