Isolamento delle cellule stromali dell'endometrio umane per In Vitro decidualizzazione
Summary
Questo studio presenta una procedura convalidata e ottimizzata per l’isolamento e la coltura delle cellule stromali dell’endometrio umane per condurre l’analisi in vitro decidualizzazione. Inoltre, questo studio fornisce un metodo dettagliato per atterramento in modo efficiente un gene specifico utilizzando siRNA in cellule stromal dell’endometrio umane.
Abstract
La differenziazione delle cellule stromale dell’endometrio umane (HESC) da fibroblasto-come l’apparenza nella decidua secretiva è una trasformazione necessaria per l’impianto dell’embrione nella mucosa uterina del grembo materno. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e conseguente aborto spontaneo precoce l’embrione. Pertanto, comprendere i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione è vantaggioso per migliorare il tasso di nascite di successo. In vivo basato su studi di decidualizzazione artificiali sono spesso limitanti a causa di dilemmi etici connessi con la ricerca umana, come pure traslazionale complicazioni all’interno di modelli animali. Di conseguenza, saggi in vitro mediante colture cellulari primarie sono spesso utilizzate per esplorare la modulazione della decidualizzazione tramite ormoni. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l’isolamento di HESC e successive decidualizzazione artificiale tramite il completamento di ormoni al mezzo di coltura. Inoltre, questo studio fornisce un metodo ben progettato per atterramento qualsiasi gene di interesse utilizzando siRNA basata sui lipidi transfezioni. Questo protocollo consente l’ottimizzazione della purezza di cultura così come la resa del prodotto, in modo da massimizzare la capacità di utilizzare questo modello come un metodo affidabile per capire i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione e la successiva quantificazione del agenti secreti dalle cellule stromali dell’endometrio proteina.
Introduction
Tra le tappe del menarca e la menopausa, le donne dell’età riproduttiva subiscono cicli mensili di ormone-regolata proliferazione dell’endometrio, la differenziazione e il successivo spargimento in preparazione per la gravidanza in un processo noto come mestruazioni1 ,2. Tali modifiche fisiche dell’endometrio umano sono necessari per l’impianto di embrione corretta nel parete uterina1. Alterazioni dell’endometrio, compresi gli adattamenti sia morfologici e biochimici, sono mediate durante il ciclo mestruale tramite ormoni steroidi ovarici estrogeni e progesterone (P4)3,4,5. Entro la fase proliferativa (o follicolare), estrogeno preovulatorio i livelli aumentano, avviando l’ispessimento dell’endometrio. Dopo l’ovulazione, la fase secretiva (o luteinica) promuove un aumento significativo delle concentrazioni di P4, che induce la trasformazione morfologica delle cellule stromali dell’endometrio (ESC) da fibroblasto-come l’apparenza arrotondati, epiteliale-come le cellule deciduali in un processo noto come decidualizzazione4,6. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e successivi primi embrione aborto spontaneo4,7,8. Di conseguenza, comprendere i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione è vantaggioso per la diagnosi ed il trattamento di perdita iniziale di gravidanza.
Attualmente, diverse metodologie sono utilizzati per esplorare gli effetti sottostanti di decidualizzazione su cellule stromal dell’endometrio. In vivo, l’utero del mouse può essere indotta artificialmente per decidualizzazione tramite stimolazione meccanica (cioè, graffiare) o iniezione in un utero ormonalmente innescato9di olio. Distinti dagli esseri umani, questa stimolazione sintetica promuove la differenziazione del lume uterino fornendo l’aspetto della presenza di blastocisti, un passo necessario per l’avvio di decidualizzazione in roditori10,11. Di conseguenza, a causa delle complicazioni traslazionale associate modelli animali e i dilemmi etici che circondano in vivo basato su studi in esseri umani, sono più correttamente studiati modelli decidualizzazione basato in vitro.
In questo studio, gli oggetti vengono reclutati attraverso il collocamento di pubblicità in entrambi i giornali locali inglese e spagnolo. Soggetti identificati come idonei per questo studio sono portati dentro per soddisfare con il coordinatore della ricerca, in cui una rilevazione completa dei rischi potenziali sono discussi. Al momento della conferma di una completa comprensione dei potenziali rischi, consenso degli oggetti è raggiunto in forme sia scritte che verbali. Consenso della persona interessata include autorizzazione di (1) subiscono il deposito (2) a lungo termine flebotomia dei loro tessuti per scopi di ricerca futura e (3) d’accordo per la creazione di colture primarie da esemplari raccolti del tessuto. A seguito di consenso, gli oggetti sono dati un modulo da compilare in cui consentito autoidentificazione di razza/etnia e/o il diritto di non divulgazione. Una successiva visita è prevista per raggiungere la biopsia dell’endometrio basata sul ciclo mestruale del soggetto. Volontari reclutati per questo studio riflettono entrambi la demografia etnica e razza della regione metropolitana di St. Louis, come documentato dal censimento del 2012 e non hanno coinvolto la partecipazione di qualsiasi popolazione vulnerabili, tra cui donne incinte, feti, embrioni, bambini sotto i 18 anni di età, o di altri gruppi vulnerabili. Requisiti di ammissibilità per la partecipazione alla raccolta del campione di biopsia includono (1) essere tra i 18-45 anni (2) avere cicli mestruali regolari (25-32 giorni) (3) non avendo attuale gravidanza o uso di contraccettivi ormonali/intrauterina dispositivo per 30 giorni prima dell’arruolamento (4) non avendo attuale infezione vaginale o malattie sessualmente trasmissibili (5) avendo nessuna correnti trattamenti antibiotici e (6) non avendo nessuna corrente Pap test anormale.
All’interno di questo studio, le cellule stromale dell’endometrio umane (HESC) sono coltivate e artificialmente indotte per subire in vitro decidualizzazione attraverso il completamento di ormoni (estradiolo (E2), medrossiprogesterone acetato (MPA) e adenosina ciclica monofosfato ciclico (cAMP)) al mezzo. In questo metodo, il grado di decidualizzazione è alterato basata sul numero totale di giorni di trattamento ormonale. In concomitanza con la riorganizzazione del citoscheletro, completamento ormonale induce adattamenti biochimici in cui le cellule deciduali esperienza qualità secretiva-come2,4. L’espressione dei geni di segno distintivo, come la prolattina (PRL) e proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 1 (IGFBP1), possa essere utilizzata per confermare e quantificare il grado di HESC decidualizzazione5,12, 13 , 14. d’importanza, è dimostrata anche la vitalità di questo protocollo per condurre atterramento specifico gene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il ciclo mestruale femminile riproduttivo è caratterizzato da un aumento nei livelli di progesterone durante la fase luteale, quindi inducendo la decidualizzazione dell’ESC in tondo, epiteliale-come le cellule secretive3,8. L’iniziazione di decidualizzazione è specie dipendenti. In esseri umani, decidualizzazione si verifica spontaneamente al momento l’aumento della concentrazione del progesterone, mentre topi richiedono blastocisti presenza10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
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