Изоляции человека эндометрия стромальных клеток In Vitro Decidualization
Summary
Это исследование представляет проверяемое и оптимизированы процедуры для изоляции и культуры стромальных клеток человека эндометрия проводить в пробирке decidualization assay. Кроме того это исследование предоставляет подробный метод эффективно нокдаун конкретных генов, используя малые интерферирующие РНК в клетках стромы человека эндометрия.
Abstract
Дифференциация эндометрия стромальных клеток человека (Госкомсанэпиднадзором) от фибробластоподобных появление в секреторную decidua является преобразования, необходимые для имплантации эмбриона в слизистую оболочку матки в материнской утробе. Неправильное decidualization был создан как причины для имплантации неудачи и последующих раннего эмбриона выкидыша. Таким образом понимание молекулярных механизмов лежащих в основе decidualization выгодно повышение показателя успешных родов. В естественных условиях на основе исследования искусственных decidualization часто ограничения вследствие этических дилемм, связанных с исследований человеческого, а также поступательное осложнения в течение животных моделей. В результате в пробирке анализов через культуры главной ячейки часто используются для изучения модуляции decidualization через гормоны. Это исследование содержит подробный протокол для изоляции Госкомсанэпиднадзором и последующие искусственные decidualization через добавок гормонов в среде культивирования. Кроме того это исследование предоставляет хорошо продуманных метод нокдаун любой ген интереса, используя transfections на основе липидов siRNA. Этот протокол позволяет оптимизацию культуры чистоты, а также выход продукта, тем самым максимального способность использовать эту модель как надежный способ понять молекулярные механизмы, лежащих в основе decidualization и последующее количественная оценка выделяется агенты decidualized стромальные клетки эндометрия.
Introduction
На этапах менструации и менопаузы женщин репродуктивного возраста проходят месячные циклы гормона регулируется эндометрия распространения, дифференциация и последующих пролить в рамках подготовки к беременности в процессе, известном как менструация1 ,2. Такие физические изменения человеческого эндометрия являются необходимыми для надлежащего эмбриона имплантации в матки стены1. Изменения эндометрия, включая биохимические и морфологические адаптации, опосредованного на протяжении менструального цикла через яичников стероидных гормонов эстрогена и прогестерона (P4)3,4,5. В течение этапа пролиферативной (или фолликулярной) preovulatory эстроген уровнях увеличения, инициирование утолщение эндометрия. После овуляции фазы секреторной (или лютеиновой) способствует значительное увеличение концентрации P4, вызывая морфологических трансформации эндометрия стромальных клеток (ESC) от фибробластоподобных внешний вид к округлые, децидуальной клетки эпителия как в процессе, известном как decidualization4,6. Неправильное decidualization был создан как причины для отказа имплантации и последующих раннего эмбриона выкидыш4,7,8. Таким образом понимание молекулярных механизмов лежащих в основе decidualization выгодно для диагностики и лечения ранних потери беременности.
В настоящее время несколько методов используются для изучения базовых эффектов decidualization на стромальные клетки эндометрия. В естественных условиях, мыши матки может быть искусственно вызываемые для decidualization через механической стимуляции (т.е., царапин) или масло инъекций в гормонально загрунтовать матки9. Отличаются от людей, это синтетический стимуляции способствует дифференциация матки люмен, обеспечивая появление бластоциста присутствия, шаг, который требуется для инициирования decidualization грызунов10,11. Соответственно, поступательные осложнения, связанные с Животные модели и этические дилеммы, окружающих в естественных условиях на основе исследования на людях, decidualization на основе модели наиболее успешно изучал в пробирке.
В этом исследовании предметы набираются через размещение рекламы в обоих местных газетах английский и испанский. Предметы, которые определены в качестве подходящих кандидатов для этого исследования привлекаются встретиться с координатором исследований, в котором обсуждаются полное раскрытие потенциальных рисков. После подтверждения полного понимания потенциальных рисков достигается согласие испытуемых в письменной и устной формах. Предметом согласия включает разрешение (1) проходят кровопускания (2) длительного хранения их тканей для будущих исследований и (3) согласиться на создание первичных культур от ткани собранных образцов. После согласия темы даны формы для завершения в которых разрешается самоидентификации расы/этнической принадлежности и/или право неразглашения. Последующий визит планируется достичь биопсию эндометрия, основанный на субъекта менструального цикла. Добровольцев, набираемых для этого исследования отражают этнические и расовые демография в Сент-Луисе митрополит регионе как документально подтверждено 2012 переписи и не с участием любых уязвимых групп населения, в том числе беременные женщины, плод, эмбрионы, Дети до 18 лет возраста, или других уязвимых групп. Требования для участия в коллекции биопсии образца включают (1) людей в возрасте от 18-45 лет (2), имеющих регулярный менструальный цикл (25-32 дней), (3) не имея текущий беременности или использование гормональных/внутриматочные контрацептивы за 30 дней до подачи заявок (4) без текущего вагинальной инфекции и венерических заболеваний (5) не текущего лечения антибиотиками, и (6) имея не текущей пап.
В рамках этого исследования культурный и искусственно вызванного пройти в пробирке decidualization через добавок гормонов (эстрадиола (Е2), медроксипрогестерона ацетат (МПа) и циклической аденозин стромальные клетки человека эндометрия (Госкомсанэпиднадзором) монофосфат (лагерь)) в среде. В этом методе степень decidualization изменяется основанный на общее количество дней гормонального лечения. В сочетании с цитоскелета перегруппировки гормональных добавок индуцирует биохимической адаптации, в которых децидуальной клетки опыт секреторной подобных качеств2,4. Экспрессии генов, отличительной чертой, как Пролактин (ПРЛ) и белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 1 (IGFBP1), могут быть использованы для подтверждения и количественно оценить степень Госкомсанэпиднадзором decidualization5,12, 13 , 14. Важно отметить, что также продемонстрировал жизнеспособность этого протокола для проведения конкретных нокдаун гена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Женского репродуктивного менструального цикла характеризуется ростом уровня прогестерона течение лютеиновой фазы, тем самым вызывая decidualization ESC в круглых, эпителиальные как секреторные клетки3,8. Начало decidualization является зависимых видов. В организме чел…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы не имеют ничего сообщать.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
