Isolering af menneskelige endometrie stromale celler til In vitro- Decidualization
Summary
Denne undersøgelse præsenterer et godkendt og optimeret procedure for isolation og kultur af human endometrie stromale celler til at gennemføre i vitro decidualization analyse. Yderligere, denne undersøgelse giver en detaljeret metode til effektivt knockdown et bestemt gen ved hjælp af siRNAs i menneskelige endometrie stromale celler.
Abstract
Differentiering af humane endometrie stromale celler (menneskelige Stamceller) fra fibroblast-lignende udseende til sekretoriske decidua er en transformation, der kræves til embryo implantering i livmoderslimhinden mødre livmoderen. Forkert decidualization er blevet oprettet som en grundlæggende årsag til implantation fiasko og efterfølgende tidlig embryo abort. Derfor er forstå de molekylære mekanismer bag decidualization en fordel at forbedre hastigheden af vellykkede fødsler. In vivo baseret undersøgelser af kunstige decidualization er ofte begrænsende på grund af etiske dilemmaer forbundet med human forskning samt translationel komplikationer i dyremodeller. Som et resultat, er in vitro- assays gennem primære cellekultur ofte udnyttet til at udforske graduering af decidualization via hormoner. Denne undersøgelse giver en detaljeret protokol for isolering af menneskelige Stamceller og efterfølgende kunstige decidualization via tilskud af hormoner til dyrkningsbaserede medium. Yderligere, denne undersøgelse giver et veldesignet metode til knockdown enhver gen af interesse ved at udnytte lipid-baserede siRNA transfections. Denne protokol tillader optimering af kultur renhed samt produkt udbytte, hvilket maksimerer muligheden for at udnytte denne model som en pålidelig metode til at forstå de molekylære mekanismer bag decidualization, og den efterfølgende kvantificering af udskilles agenter af decidualized endometrie stromale celler.
Introduction
Mellem stadier af første menstruation og overgangsalder undergår kvinder i den fødedygtige alder månedlige cyklusser af hormon-regulerede endometrie spredning, differentiering og efterfølgende afgivelse i forberedelse til graviditet i en proces kendt som menstruation1 ,2. Sådanne fysiske ændringer af den menneskelige endometriet er nødvendige for korrekt embryo implantering i livmodervæggen1. Ændringer i endometriet, herunder morfologiske og biokemiske tilpasninger, er medieret gennem hele menstruationscyklus via æggestokkene steroid hormoner østrogen og progesteron (P4)3,4,5. Inden for den proliferative (eller follikulært) fase, preovulatory østrogen niveauer stigning, iværksætte endometriet fortykkelse. Efter ægløsning fremmer den sekretoriske (eller luteal) fase en betydelig stigning i P4 koncentrationer, inducerende morfologiske omdannelsen af endometrie stromale celler (ESC) fra fibroblast-lignende udseende til afrundet, epithelial-lignende decidual celler i en proces kendt som decidualization4,6. Forkert decidualization er blevet oprettet som en grundlæggende årsag til implantation fiasko og efterfølgende tidlig embryo abort4,7,8. Derfor er forstå de molekylære mekanismer bag decidualization fordelagtig for diagnosticering og behandling af tidlig graviditet tab.
I øjeblikket er flere metoder udnyttet til at udforske underliggende virkningerne af decidualization på endometrie stromale celler. In vivo, mus livmoderen kan fremkaldes kunstigt for decidualization via mekaniske stimulation (dvs., skrabe) eller olie injektion i en hormonrelaterede PRIMES livmoderen9. Adskilt fra mennesker, denne syntetiske stimulation fremmer differentiering af uterin lumen ved at give udseende af blastocyst tilstedeværelse, et skridt, der er nødvendig for indledningen af decidualization i gnavere10,11. Derfor, på grund af translationel komplikationer forbundet med dyremodeller og de etiske dilemmaer omkring i vivo baseret undersøgelser hos mennesker, decidualization baserede modeller er mest held studerede in vitro-.
I denne undersøgelse rekrutteres emner gennem placeringen af reklamer i både engelsk og spansk Lokalaviser. Emner identificeret som egnede kandidater til denne undersøgelse er bragt at mødes med koordinatoren for forskning, som en fuld offentliggørelse af potentielle risici diskuteres. Efter bekræftelse af en komplet forståelse af potentielle risici, er registreredes samtykke opnået i både skriftlige og mundtlige former. Emnet samtykke omfatter tilladelse til (1) gennemgå tapning (2) på langtidsopbevaring af deres væv for fremtidig forskning og (3) tilslutter sig oprettelsen af primære kulturer fra enheder, der opsamlet væv. Efter samtykke får emner en form for at fuldføre i som tilladt selv-identifikation af race/Etnicitet og/eller ret til hemmeligholdelse. Et efterfølgende besøg er planlagt til at nå endometriet biopsi baseret på motivets menstruationscyklus. Volontører rekrutteret til undersøgelsen afspejler både etniske og racemæssige demografi af St. Louis metropolitan region, som dokumenteret af folketællingen i 2012 og indebærer ikke deltagelse af alle sårbare befolkning, herunder gravide kvinder, fostre, embryoer, børn under 18 år af alder eller andre sårbare grupper. Krav for deltagelse i biopsi prøve samling omfatter (1) at være i alderen 18-45 år (2) der har regelmæssig menstruationscyklus (25-32 dage) (3) har ingen aktuelle graviditet eller brug af hormonel/intrauterin enhed prævention for 30 dage før tilmelding (4) har ingen aktuelle vaginal infektion eller seksuelt overførte sygdomme (5) har ingen aktuelle antibiotika behandlinger, og (6), hvis ingen aktuelle unormal celleprøve.
Inden for denne undersøgelse, menneskelige endometrie stromale celler (menneskelige Stamceller) kulturperler og kunstigt fremkaldt til undergår in vitro- decidualization gennem tilskud af hormoner (estradiol (E2), medroxyprogesteronacetat (MPA) og cyklisk adenosin monophosphate (cAMP)) til medium. I denne metode ændres graden af decidualization baseret på det samlede antal dage af hormonel behandling. I forbindelse med cytoskeletal omlejring inducerer hormonel supplering biokemiske tilpasninger, hvor de decidual celler opleve sekretoriske-lignende kvaliteter2,4. Udtryk af hallmark gener, som prolaktin (PRL) og insulin-lignende vækstfaktor bindende protein 1 (IGFBP1), kan udnyttes til at bekræfte og kvantificere graden af menneskelige Stamceller decidualization5,12, 13 , 14. vigtigere, levedygtigheden af denne protokol til at foretage genet specifikke knockdown fremgår også.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den kvindelige reproduktive menstruationscyklus er karakteriseret ved en stigning i progesteron niveauer i hele den luteale fase, dermed inducere decidualization af ESC i runde, epithelial-lignende sekretoriske celler3,8. Indledningen af decidualization er arter afhængige. Hos mennesker opstår decidualization spontant på stigningen i progesteron koncentrationen, mus kraever blastocyst tilstedeværelse10,11</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
