신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법
Summary
여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.
Abstract
혈액-뇌 장벽 (BBB)은 다양 한 병 태 생리 및 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽 조직. 이러한 자극 으로부터 발생 하는 이러한 변경 고 수 있습니다 크게 뇌에 약물 전달 조절, 확장 하 여, 질병의 원인이 상당한 도전 중앙 신경 치료에서 (CNS). Pharmacotherapy에 영향을 주는 많은 BBB 변화를는 지역화 된 내 피 세포의 수준에서 단백질을 포함 한다. 실제로, 건강 및 질병에 BBB 생리학에 이러한 지식은이 막 단백질의 연구에 상당한 관심을 촉발 했다. 기초 과학 연구의 관점에서이 실험 동물에서 수확 하는 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하지만 강력 하 고 재현할 수 방법에 대 한 요구를 의미 합니다. 갓 격리 된 microvessels에서 막 샘플을 준비 하기 위하여 샘플 준비 내 피 세포에 농축 되어야 하지만 다른 세포 유형 (즉, 이다, microglia, 신경, 혈관 단위의 존재 제한 필수적 이다 pericytes)입니다. 추가 혜택 개별 동물에서 실험적인 인구에서 단백질 식의 진정한 변화를 캡처하기 위해 샘플을 준비 하는 기능입니다. 이 원고에서 쥐 뇌 microvessels의 고립과 막 샘플의 준비에 대 한 활용 방법에 관한 세부 정보는 제공 됩니다. Microvessel 농축, 파생, 샘플에서 dextran 샘플 버퍼에 포함 된 4 개의 원심 분리 단계를 사용 하 여 이루어집니다. 이 프로토콜은 그들의 자신의 특정 응용 프로그램에 대 한 다른 실험실에 의해 쉽게 적응 수 있습니다. 이 프로토콜에서 생성 된 샘플 크게 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극 응답 BBB의 이해를 원조 할 수 있는 단백질 분석 실험에서 강력한 실험 데이터를 얻을를 보였다.
Introduction
혈액-뇌 장벽 (BBB) 중앙 신경 시스템 (CNS)와 조직의 순환 간의 인터페이스에 존재 하 고 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할. 구체적으로, 정확 하 게 제어 용 질 농도에 효율적으로 뇌 조직 CNS1의 상당한 변화 요구를 충족 하는 데 필요한는 그 영양분을 공급 하 고 뇌 세포 외 액에는 BBB 기능. 이러한 역할 의미 microvascular 내 피 세포의 수준에 있는 BBB 잠재적으로 유해한 xenobiotics 수 없습니다 하면서 뇌 실질에 액세스 하는 일부 물질을 사용할 수 있는 개별 메커니즘을가지고 있어야 합니다. 축적. 사실, microvascular 내 피 세포 fenestrated 하지 않습니다 하 고 비 선택적인 침투성2의 부족을 보장 제한 pinocytosis 전시. 또한, microvessel 내 피 세포 꽉 접점과 외화 접합 단백질 형태로 실제 인접 한 내 피 세포 사이의 “봉인”과 뇌에 혈액을 매개로 물질의 paracellular 확산을 크게 제한 하는 표현 실질입니다. 사실, 내 인 성 및 외 인 성 물질의 선택적인 침투성의 통풍 관 및 경과 전송기3기능 식이 필요합니다. 전반적으로, 단단한 접속점, 외화 교차점, 및 전송기는 BBB의 독특한 장벽 속성을 유지 하기 위해 콘서트에서 작동.
BBB는 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽이 다. 예를 들어 산소/reoxygenation 스트레스는 혈관 마커 등을 증가 paracellular 침투성와 관련 중요 한 꽉 접합 단백질 (즉, occludin, zonulae occluden-1 (조로-1))의 식을 조절 하 보였다 자당4,,56으로. 외상 성 뇌 부상7 설정 주변 염증 성 통증8,9에서 BBB에서 비슷한 관찰 되었습니다. 이 같은 질병 또한 BBB10,,1112,13,14에서 전송 메커니즘을 조절 수 있습니다. 실제로, 저 산소 증/reoxygenation 부상 향상 polypeptide 1a4 수송 유기 음이온의 기능 식 (Oatp1a4)에서 BBB,으로 이어질 수 있는 특정 Oatp 전송 기판의 혈액-뇌 전송에 상당한 증가 같은 taurocholate 및 틴이13. BBB 속성 pharmacotherapy 자체, 뇌에 약물 효과에 모두 깊은 변화 및 약물-약물 상호 작용에 대 한 기초를 형성 수 있습니다 메커니즘에 의해 변경할 수 있습니다. 예를 들어 뇌 microvascular 내 피 세포에 아 세트 아미노 펜 대상 핵 수용 체 신호 메커니즘 기능 표현의 중요 한 경과 전송 P-당단백질 (P-gp), 증가 하 고 수정 하는 시간에 따른 진통 모 르 핀에 의해 수 여 된 opioid 진통제 약물 설립된 P-gp 수송 기판15. BBB 변화, 질병 또는 약물에 의해 유도 될 수 있다, 그의 철저 한 이해는 또한 식별 및 이러한 수정을 제어 하는 특정 규제 메커니즘의 필요 합니다. 사실, 이산 신호 경로 꽉 접합 단백질16,17 및 전송기15, 의 분자 표현 제어 하는 두뇌 microvascular 내 피 세포에서 발견 되었습니다 18,19. 함께 찍은, 이러한 관측 복잡 한 분자 경로 BBB 꽉 접합의 규제와 건강 및 질병에 전송기에 관련 된 나타냅니다.
BBB의 연구에 중요 한 도전 막 샘플의 후속 준비 및 실험 동물에서 파생 된 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법의 절대적인 요구 사항입니다. 이 샘플은 모두 뇌 microvascular 내 피 세포에 농축 하 고 다른 세포 유형의 존재에 제한 준비 되어야 한다. 지난 몇 년 동안 설치류 두뇌에서 microvasculature의 격리에 대 한 여러 방법론 과학 문학13,20,,2122에 보고 되었습니다. 이 문서에서는 간단 하 고, 강력한, 및 쥐 두뇌에서 microvessels의 격리 및 단백질 발현의 분석에 사용할 수 있는 내 피 막 농축 샘플의 준비에 대 한 재현 방법. 이 microvessel 격리 프로토콜의 한 장점은 개별 실험 동물에서 충분 한 단백질 수율과 높은 품질의 샘플 준비를 얻을 수 있습니다. 단백질 표정에 간 동물 다양성의 고려 수 있습니다. BBB에서 단백질 변경의 진정한 크기의 과대평가 (또는-추정) 수 이제 피할 수 있기 때문에이 프로토콜에는 이러한 사전은 크게 BBB 연구의 견고성을 향상. 또한, 여러 원심 분리 단계 dextran 포함 뉴런 등 원치 않는 세포 성분의 제거를 촉진 하는 동안 실험 샘플에서 microvessels의 향상 된 농축 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 갓 쥐 뇌 조직에서 분리 된 microvessels에서 막 단백질 샘플 준비의 간단 하 고 효과적인 방법을 설명 합니다. 격리 된 microvasculature에서 쥐 뇌 microvessels의 격리 및 막 준비의 세대에 대 한 몇 가지 방법은 문학13,20,,2122 에 보고 되었습니다. , 24.이 이렇게 하나의 실…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 PTR에 건강의 국가 학회 (R01-NS084941)와 애리조나 생물 의학 연구 위원회 (ADHS16-162406)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. WA는 과거의 국가 연구소의 건강 교육 부여 (T32-HL007249)을 미리 박사 약속에서 지원 받았다.
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
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