Bedömningen av lönsamheten för ett syntetiskt bakteriell konsortium för värd-mikrob In Vitro Gut gränssnittet
Summary
Gut värd-mikrobinteraktioner bedömdes med hjälp av en ny metod som kombinerar en syntetiska orala gemenskap, i vitro gastrointestinala matsmältning och en modell av tunntarmen epitel. Vi presenterar en metod som kan anpassas för att utvärdera cell invasion av patogener och flera arter biofilmer, eller ens att testa probiotiska formuleringar överlevnadsförmåga.
Abstract
Samspelet mellan värd och bakterieflora har länge erkänt och utförligt beskrivs. Munnen är liknande till andra delar av mag-tarmkanalen, som bosatt bakterieflora uppstår och förhindrar kolonisation av exogena bakterier. Faktiskt mer än 600 arter av bakterier förekommer i munhålan, och en enda individ kan bära omkring 100 olika när som helst. Orala bakterier besitter förmågan att följa olika nischer i orala ekosystemet, alltså blir integrerat inom bosatt mikrobiella samhällen, och främjar tillväxt och överlevnad. Flödet av bakterier i tarmen vid sväljning har dock föreslagits att störa balansen i tarmfloran. I själva verket skiftade oral administrering av P. gingivalis bakteriell sammansättning i den ileal mikrofloran. Vi använde en syntetisk gemenskap som en förenklad framställning av naturliga muntliga ekosystem, för att belysa överlevnad och lönsamhet av orala bakterier utsätts för simulerad gastrointestinal transit villkor. Fjorton arter markerade, utsattes för in vitro- saliv, mag och tarm matsmältningen processer, och presenteras i en multicompartment cell modell innehållande Caco-2 och HT29-MTX celler för att simulera slemhinnor tarmepitelet. Denna modell serveras nysta effekterna av förtäring bakterier på celler involverade i det enterohepatiska kretsloppet. Med hjälp av syntetiska samhällen tillåter styrbarhet och reproducerbarhet. Således, denna metod kan anpassas att bedöma patogen livskraft och påföljande inflammation-associerade ändringar, colonization kapacitet av probiotiska blandningar, och i slutändan potentiella bakteriell inverkan på presystemisk cirkulationen.
Introduction
Människor sammanbor med bakterier som är närvarande vid samma nummer som mänskliga celler1. Därför är det av avgörande viktigt att få en omfattande förståelse av den mänskliga mikrobiomet. Munhålan är en unik miljö i att den är uppdelad i flera mindre livsmiljöer, som alltså innehåller en stor mängd bakterier och biofilm i dessa olika platser. Att vara ett öppet ekosystem, kan vissa arter i munnen vara övergående besökare. Dock kolonisera vissa mikroorganismer snart efter födelsen och form organiserade biofilmer2. Dessa finns i tändernas yta ovanför den gingivala skreva, subgingival skreva, tungan, slemhinnorna och protetik och fyllningar3. Bakterier kan också vara närvarande som flockar och plankton celler i lumen av kanalen tand, blandade med nekrotisk massa vävnad eller upphängd i en vätska fas.
Det finns aktiva, kontinuerlig överhörning mellan värdceller och bosatt bakterieflora4. Bakterier kommunicera inom och mellan arter, och endast en liten del av naturliga kolonisatörerna kan följa vävnader, medan andra bakterier tillmäter dessa primära kolonisatörerna. Till exempel är cell cell bindning mellan mikroorganismer nyckeln för att integrera sekundära kolonisatörerna i oral biofilm och bygga komplexa nätverk av samverkande mikrobiella celler4. Omkring bildas 70% av bakteriell aggregat i ett salivprov genom Porphyromonas sp., Streptococcus sp., Prevotella sp., Veillonella sp. och oidentifierade Bacteroidetes. F. nucleatum är en mellanliggande kolonisatör i subgingival biofilm och aggregat med sena kolonisatörerna P. gingivalis, T. denticola, och Tannerella forsythia, som är inblandade i parodontit5. Dessutom upptar Streptococcus mitis både slemhinnor och dental livsmiljöer, medan S. sanguinis och S. gordonii föredrar att kolonisera tänder3. Således är, S. sanguinis närvarande i nedre framtänder och hörntänder, medan Actinomyces naeslundii har hittats i övre anteriors6.
Dessutom spelar den inhemska mikrobiomet en roll för att upprätthålla mänsklig hälsa2. Bosatt bakterieflora deltar i immun utbildning och att förebygga patogen expansion. Detta kolonisering motstånd beror på att de infödda bakterierna kan vara bättre anpassad i knutna till ytor och effektivare på metabolising de tillgängliga näringsämnena för tillväxt. Även om probiotiska stammar överleva tidens gastrointestinala och förbli aktiva, har varaktigheten av autoktona bakterier förtäring från en övre läge i mag-tarmkanalen inte fullt beskrivits. Således utsätts vi en konstgjord gemenskap, företrädare för det orala ekosystemet, simulerade gastrointestinal transit villkor. Livskraften hos bakterieceller bedömdes med hjälp av en multicompartment modell som liknar tarmepitelet. Nuvarande gut simulatorer erbjuder lämplig reproducerbarhet när det gäller analys av luminala mikrobiell gemenskapen7. Dock behandlas bakteriell vidhäftning och värd-mikrob interaktion separat, som kombinerar cellinjer med mikrobiella samhällen är utmanande8. Däremot presenterar vi en ram som ger potentiella mekanistisk förklaring av framgångsrika colonization händelser rapporterade i gut-gränssnittet. Faktiskt kan denna modell tillsammans användas med en statisk gut modell för att utvärdera effekterna av mikrobiella samhällen på värd yta signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den muntliga mikrobiomet är en nyckelfaktor i människors hälsa som nyligen rapporterats av flera författare20,21. Tidigare fynd tyder på att intag av saliv som innehåller stora laster av bakterier kan påverka den mikrobiella ekosystemen av tunntarmen, som är en av de viktigaste platserna för immun priming. Kombinationen av en statisk övre gastrointestinala matsmältningen modell med värd gränssnittet representeras av intestinal epitel och slem som uts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt finansiellt stöd från stiftelsen Flandern forskning till Marta Calatayud Arroyo (CVE postdoktorala gemenskap-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria är postdoktor stöds av Flandern Innovation och entreprenörskap (Agentschap voor Innovatie dörren Wetenschap sv Technologie, IWT).
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al., Verhoeckx, K., et al. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
