Calorespirometry: En kraftfull, icke-invasiv metod att undersöka cellernas energimetabolism
Summary
Det här protokollet beskriver calorespirometry, direkta och samtidig mätning av både värmeavledning och andning, som ger en icke-invasiv metod för att bedöma energimetabolism. Denna teknik används för utvärdering av bidraget av både aeroba och anaeroba vägar till energiutnyttjande genom att övervaka det totala cellular energiflödet.
Abstract
Många cellinjer som används i biologisk och biomedicinsk grundforskning upprätthålla energi homeostas genom en kombination av både aerob och anaerob respiration. Den utsträckning som båda vägar bidrar till landskap av cellulär energiproduktion är dock konsekvent förbisedd. Celler odlade i mättar glukosnivåerna ofta visar en minskad beroende på oxidativ fosforylering för ATP produktionen, vilket kompenseras av en ökning av substrat-nivå fosforylering. Detta skifte i metabola poise tillåter celler för att föröka trots närvaron av mitokondriell toxiner. I försumma den förändrade metaboliska balans av celler, resultat från en farmaceutisk screening kan misstolkas sedan den potentiellt mitotoxic effekter kan inte identifieras med hjälp av modell cellinjer odlade i närvaro av hög glukos koncentrationer. Det här protokollet beskriver hopkoppling av två kraftfulla tekniker, respiration och calorimetry, vilket möjliggör kvantitativa och icke-invasiv bedömning av både aeroba och anaeroba bidrag till cellulär ATP produktionen. Både aeroba och anaeroba respirations generera värme, vilket kan vara övervakade via kalorimetri. Samtidigt kan mäta graden av syreförbrukning bedöma omfattningen av aerob respiration. När både värmeavledning och syreförbrukning mäts samtidigt, kan calorespirometric förhållandet bestämmas. Experimentellt erhållna värdet kan sedan jämföras med de teoretiska oxycaloric motsvarande och omfattningen av den anaeroba andningen kan bedömas. Calorespirometry ger således en unik metod för att analysera en rad biologiska frågor, inklusive läkemedelsutveckling, mikrobiell tillväxt och grundläggande bioenergetik under både normoxic och hypoxisk villkor.
Introduction
I biologiska system, värme-release eller entalpi förändringen under metabolismen är vanligtvis övervakas antingen direkt (via direkt calorimetry) eller indirekt via O2 konsumtion eller CO2 produktion (via respiration). Tyvärr, när dessa tekniker används i isolering, kritisk information går förlorad, såsom bidrag till anaerob vägar till cellulär metabolism. Calorespirometry är en kraftfull teknik som bygger på samtidig mätning av både värmeavledning och andning. Banbrytande calorespirometric arbete undersökt anaerob metabolism i fullt syresatt däggdjursceller och visat samtidiga bidragen från både aeroba och anaeroba vägar till energi homeostas trots transformerade celler i en fullt syresatt miljö1. Calorespirometry har sedan dess kopplats till ett brett utbud av biologiska frågor. Några exempel är studiet av djurens Energetik på låga syrenivåer, effekterna av både herbicid och östrogen på gälarna musslor, metabolismen av landlevande organismer och mikrobiell nedbrytning av organiskt smuts fråga2, 3 , 4 , 5 , 6. calorespirometry har dessutom avslöjade hur metabola prekonditionering före frysning förbättrar Frysförvaring av däggdjurs-celler7. Varje strategi, både kalorimetri och respiration, självständigt har ökat vår kunskap om cellulära och organismers blockeringar. Grundläggande biologiska frågor som kan besvaras med hjälp av calorespirometry är dock fortfarande relativt outforskat.
Hess lag säger att den totala entalpi förändringen av en reaktion är oberoende av vägen mellan de inledande och avslutande staterna. Den totala entalpi förändringen för en biokemisk väg är exempelvis summeringen av förändringen i enthalpies av alla reaktioner inom vägen. Calorimetry erbjuder en realtid strategi för mätning av cellulära värmeproduktion, som urskillningslöst upptäcker både aeroba och anaeroba vägar. Detta är baserat på stiftelsen att ingen energi utbyts i systemet utom genom väggarna av experimentella ampull8. En förändring i värmeavledning är lika till förändring i entalpi släppt från alla metaboliska reaktioner i ampullen. Således korrelerar en negativ entalpi till en förlust av värme från systemet. Omfattande forskning under de senaste fyra decennierna har präglat det termodynamiska landskapet av både katabolism och anabolism. Detta representeras av en stadig ökning av forskningsartiklar som finns under de söktermer som ”biologiska” och ”kalorimetri” som indexeras av USA nationella bibliotek av Medicine (NLM) vid National Institutes of Health (PubMed). Sökningen visar att före 1970, sammanlagt 27 publikationer referens biologiska kalorimetri; under tiden i 2016 ensam utnyttjade 546 publikationer tekniken.
Kalorimetriska metoder är väletablerat att bestämma värmeproduktion. Dock beviljas mer flexibilitet för att lösa det respirometric värdet. Respirometric mätning kan bestå av O2, CO2, eller både O2 och CO2. Ytterligare, mätning av O2 eller CO2 kan ske genom olika tekniker, inklusive optrodes, Clark-typ elektroder och tunable diod laser absorption spektroskopi7,9,10 ,11. CO2 -produktion är en värdefull metriska i många respirometric studier, använder medium för odlade celler ofta en bicarbonic buffertsystem för pH kontroll12,13. För att undvika komplikationer av CO2 mätning i bikarbonat systemet, använder följande protokoll för calorespirometry av celler i kultur O2 som den enda respirometric parametern.
Samtidiga med att mäta syre flux, vissa respirometers (se Tabell för material) är utformade för detaljerade bedömningar av mitokondriell funktion. Substrat-uncoupler-hämmare-titreringar (kostym) protokoll är väl etablerade och är kompatibla med experiment som utformats för att mäta membran potentiella eller reaktiva syre arter (ROS) bildandet14. Presenterade protokollet för calorespirometry av intakta celler är kompatibel med införandet av kemiska uncouplers såsom karbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) och F0F1-ATP-syntas hämmare oligomycin. Genom tillägg av FCCP, kan syreförbrukning vara okopplade från ATP produktionen, vilket är användbart för att bedöma effekten av potentiella therapeutics på mitokondriell ‘s diesel15. Dessutom belyser tillägg av oligomycin omfattningen av läcka respiration. Således är respirometric mätningarna utförs under calorespirometry kompatibel med omfattande protokoll utformat för att ytterligare belysa mitokondriell fysiologi.
Samtidig mätning av både värmeavledning och syre flux möjliggör beräkning av förhållandet calorespirometric (SP). Denna kvot jämförs sedan med den Thorntons konstant eller den teoretiska oxycaloric motsvarande, som sträcker sig mellan -430 till-480 kJ mol-1 beroende på cellinje eller vävnad av intresse och kompletterade kol substrat1, 16. således en mer negativ baserat på CR avslöjar ökade bidrag från anaerob spridningsvägar till övergripande metabolisk aktivitet. Exempelvis förhållandet CR för rutinmässig muskel vävnad respiration utan aktiva utförandet av arbete sträcker sig från -448-468 kJ mol-1 vilket är inom spänna av den teoretiska oxycaloric motsvarande17,18. Samtidigt däggdjur cancerceller odlade i medium som är hög i glukos visar förbättrad mjölksyra jäsning efter glykolys och låga relativt mitokondriell engagemang19. Denna fenotyp resulterar i CR nyckeltal i spänna av -490 till-800 kJ mol-1, visar en ökad medverkan av de anaeroba vägarna i den cellulära metabolismen som anges av mer negativ CR nyckeltal1,7, 16,20.
Både kommersiella och ideella cell- och distributörer för närvarande erbjudande cellinjer från över 150 arter, med nästan 4.000 cellinjer som härrör från människor. Förevigade cellinjer är praktiska verktyg för att snabbt utvärdera toxiciteten av potentiella therapeutics, varav många kan direkt eller indirekt påverka mitokondriell funktion. Med hjälp av celler under drogkontroll kan vara av begränsat värde delvis på grund av Warburg effekten, ett kännetecken för många cancerformer. Ofta cancer generera ATP från substrat-nivå fosforylering och upprätthålla redox balansen genom produktion av laktat utan fullt engagerande mitokondrien under aeroba förhållanden19. Läkemedelsutveckling är notoriskt kostsamma och ineffektiva, med cirka 8 av 9 föreningar testas i kliniska prövningar inte uppnår marknaden godkännande21. Även potentiella therapeutics kan passera inledande screening på grund av låg cytotoxicitet i cellinjer, är det möjligt att vissa av dessa föreningar är mitotoxic. Utan en lämplig metod för att upptäcka hur dessa toxiner kan försämra energibalansen i primära celler som inte visar effekten Warburg, är kritisk information ofta förbisedda, genomströmning terapeutisk utveckling i tidigt skede.
Calorespirometry är en praktisk, icke-invasiv metod att analysera metabolisk aktivitet i en mängd olika biologiska prover, inklusive celler och vävnader. Kärnan i protokollet presenteras är kompatibel med en rad applikationer. En komplikation, dock har identifierats. Förevigade celler odlas ofta i ett glukos-fri medium kompletteras med galaktos att öka bidraget från oxidativ fosforylering (OXPHOS) för energiproduktion, för att medvetandegöra celler till potentiella mitotoxins22, 23. Denna metaboliska omprogrammering verkar skymma analys när prover placeras i de rostfria ampuller som används av de kalorimeter15. Celler odlade i glukos medium fortsätter att engagera sig i höga metaboliska aktiviteten i flera timmar. Samtidigt minska celler odlade i galaktos medium värmeproduktion inom 30 min av deras placering i ampullen, att göra mätningar begränsas till tidig experimentell tidpunkter. Detta beteende, hindrar tyvärr möjlighet att bedöma deras cellulära spridning. Trots denna särskilda begränsning, de flesta program är kompatibla med calorespirometric analys och detaljerad metabola information kan erhållas genom detta tillvägagångssätt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syftet med calorespirometry är att kvantitativt bedöma bidragen av aerob och anaerob vägar till metabolisk aktivitet och få en sammansatt bild av cellulär energi flux. Detta sker genom samtidig mätning av värmeavledning och syre flux följt av en jämförelse mellan beräknade CR förhållandet med den teoretiska oxycaloric motsvarande. Flera kritiska steg måste övervägas för reproducerbara och tillförlitliga uppgifter. Underhåll av en steril, frisk cellkultur är kritisk. Kontamination av bakterier eller sv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var delvis finansierad av National Science Foundation bidraget CHE-160944 Mary E. Konkle och Michael A. Menze.
Materials
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum – Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E., Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. , 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. . Human Calorimetry. , (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. 암 연구학. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
