Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

요약

여기, 선물이 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 세포의 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜.

초록

관상동맥 폐색된의 신속 하 고 효율적인 reperfusion ST 세그먼트를 가진 환자에서 심근 경색 크기를 감소에 대 한 최선의 전략 상승 심근 경색 이다. 그러나, reperfusion 라기보다 발생할 수 있습니다 추가 cardiomyocyte 죽음, reperfusion 상해로 알려진 현상. (MMP), 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 감소와 미토 콘 드리 아의 도발은 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 공 (mPTP)의 오프닝 reperfusion 상해의 마지막 단계로 보편적으로 인식 되 고에 대 한 책임은 미토 콘 드리 아와 cardiomyocyte 죽음. JC-1 MMP의 값에 따라 미토 콘 드리 아에서 축적 되는 질 성 양이온 염료 이다. MMP, JC-1는 미토 콘 드리 아에서 축적 하는 더 높은. 미토 콘 드리 아에서 JC-1의 증가 금액에서 녹색 형광 방출 변화에 의해 반영 될 수 있다 (~ 530 nm) 빨강 (~ 590 nm). 따라서, 빨강/녹색 형광 강렬 비율의 감소는 미토 콘 드리 아의 도발은 나타낼 수 있습니다. 여기, 우리 걸릴 JC-1 MMP, 측정을 활용 또는 산소/reoxygenation, cytometry에 의해 감지 후 인간의 심장 myocytes에서 mPTP의 오프닝.

서론

관상 동맥 심장 질환 죽음은 전세계의 주요 원인입니다. 치료의 선택의 허 혈 성 상해를 줄이고 ST 세그먼트를 가진 환자에서 경색 크기 제한 상승 심근 경색 주 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI)^{1를 통해 신속 하 고 효과적인 심근 reperfusion는 2}. 그러나, reperfusion 최종 경색 크기³의 30%를 위한 계정을 수 있습니다 추가 손상이 발생 합니다. 그것은 보편적으로 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 공 (mPTP)가 뿐만 아니라 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 동안 미토 콘 드 리아 손상과 세포 죽음에 중앙 인정 (I / R), cardioprotective 신호⁴ 의 수렴 대상 이기도 하지만 ^{, 5}. 우리 mPTP 오프닝 5 ', 5를 사용 하 여 감지 mPTP 오프닝 안 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)⁴의 도발은 대해가지고 것, 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3 '-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (....

프로토콜

1입니다. 시 약 및 솔루션의 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 Myocyte 성장 매체의 500 ml Myocyte 성장 매체 보충 믹스의 25 mL를 추가 하 여 인간의 심장 myocytes (HCMs) 완전 한 매체를 준비 합니다. 4 ° C에서 37 ° c를 사용 하기 전에 따뜻한이.
2. Tongxinluo (광장) 솔루션 준비 혈 청/포도 당-무료 광장 ultrafine 분말을 용 해 하 여 Dulbecco의이 글의 중간 (DMEM)를 수정 하 고 (자세한 내용은 참조¹¹)에 대 한 DMEM을 추가 하 여 400 µ g/ml 광장의 농도 조정. 4 ° C에서 37 ° c를 사용 하기 전에 따뜻한이.
3. JC-1 재고 솔루션 (200 x), 초순, 4 mL 및 재고 버퍼 (5 배) 15 mL 원심 분리기 튜브 어둠 속에 얼룩의 1 mL의 25 µ L을 추가 하 여 제 1 작업 솔루션의 5 mL을 준비 합니다. 여러 번 왔다 갔다 혼합 플라스틱 고 37 ° C를 사용 하기 전에 따뜻한.
4. 30 mL 얼룩 버퍼 초순의 24 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 버퍼 (5 배) 얼룩 재고의 6 mL에 추가 하 여 작업을 준비 합니다. 얼음 처럼 차가운이 솔루션을 사용 합니다.

결과

MMP의 변화를 평가 하기 위해 JC-1 분석 결과 수행 하기 전에 실험 실시 성공적으로 조건을 확인 하는 연구자에 의해 설정 것이 좋습니다. 정상 그룹에 비해 교류 cytometry 결과 (그림 2)와 같이 산소/reoxygenation (H/R)는 크게 HCMs (Annexin V + /PI±)의 apoptosis 유도 우리 나의 세포 기반 모델을 설립 했다 나타내는 / R (45.00 ± 2.13 %vs. 11.50 p 일반 그룹에서 ± 0.18% < 0.05). Tongxinluo, cardioprotective 효과와 중국 전통 의학 방해 HCMs H/R의 상태에서의 apoptosis (24.50 ± 1.13% p H/R 그룹에서 45.00 ± 2.13% < 0.05).

토론

여기, 선물이 JC-1 분석 결과 의해 H/R. 검색에 노출 되 고 후 셀의 MMP를 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜, 세포의 MMP는 미토 콘 드리 아의 크기, 모양, 및 형광 단일 구성 요소에 영향을 미칠 수 밀도 같은 요인의 독립 ¹⁴신호. 따라서, JC-1 분석 결과의 결과 상대적으로 안정적 이다. 게다가, 그것은 편리 하 고 JC-1 시험 수행에 시간 절약입니다. 이 분석 결과 재료 및 시 약, 낮은 요구 사항이 고 일반적으로에서 얼룩 MMP 측정 셀 분리 할 미만 1.5 h 걸립니다.

몇 가지 중요 한 단계는 연구자 안정적이 고 만족 스러운 결과 얻을 하려는 경우 JC-1 시험을 수행할 때 과장 된 수 없습니다. 우선, JC 1 로드 셀 흐름 cytometer에 의해 수집 때까지 차가운 얼룩 버퍼에 메시지를 저장 합니다. 온도 MMP의 안정성에 상당한 영향 그리고 한 샘플의 값 실내 온도에 짧은 시간 후 많.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Beyodtime, 중국	C2006	을 가진 미토콘드리아 막 잠재력 분석 장비	장비에서 JC-1 재고 해결책 (200×), 주식 염색 완충액 (5×) 및 CCCP (10mM)
Tongxinluo ultrafine 분말	이 있습니다 스자좡 시 Yiling 제약 Co., 중국	071201
Annexin V-FITC/PI 장비	Becton-Dickinson, 미국	556547
DMEM	Life Technologies, Grand Island Biological Company, 미국	11966-025
인간 심장 근세포	프로모셀, 독일	C-12810
근세포 성장 매체 (SupplementMix)	프로모셀, 독일	C-39275
근세포 성장 배지(즉시 사용 가능)	프로모셀, 독일	C-22070	근세포 성장 배지와 함께 사용 SupplementMix
GENbox	바이오엠&에아큐트; rieux, Marcy l' Etoile, France	96127	2.5L
촉매(AnaeroPack)	MITSUBISHI GAS CHEMICAL  COMPANY, INC. , 일본	C-1
혐기성 지표	BioMé rieux, Marcy l' Etoile,	France 96118
유세포 분석기	Becton-Dickinson, 미국	FACSAria 2
BD FACSDiva 소프트웨어	Becton-Dickinson, 미국		버전 8.0.1
샘플 튜브	Corning science, 미국	352054	12*75mm
PBS	Hyclone, 미국	SH30256.01

JC-1