Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters
Summary
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die JC-1 Farbstoff verwendet, um die Mitochondrien-Membran-Potential der Zellen beurteilen nach Hypoxie/flussbettfilters mit oder ohne einem Schutzmittel ausgesetzt wird.
Abstract
Zeitnahe und effiziente Reperfusion der verschlossenen Koronararterie ist die beste Strategie zur Verringerung der Größe der myokardialen Infarkt bei Patienten mit ST-Segment Herzinfarkt erhöht. Reperfusion schlechthin kann jedoch im weiteren Cardiomyocyte Tod, ein Phänomen bekannt als Reperfusion Verletzungen führen. Die Eröffnung der mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP), mit der Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) oder mitochondriale Depolarisation ist allgemein anerkannt als der letzte Schritt der Reperfusion Verletzungen und ist verantwortlich für Mitochondriale und Cardiomyocyte Tod. JC-1 ist eine lipophile kationischen Farbstoff, der in den Mitochondrien abhängig vom Wert des MMP ansammelt. Je höher die MMP ist, desto mehr JC-1 sammelt sich in den Mitochondrien. Die zunehmende Mengen von JC-1 in den Mitochondrien können durch eine Fluoreszenz Emission Verlagerung von Grün zum Ausdruck kommen (~ 530 nm) bis rot (~ 590 nm). Daher kann die Verringerung der rot/grünen Fluoreszenz Intensitätsverhältnis die Depolarisation der Mitochondrien angegeben. Hier nehmen wir Vorteil von JC-1 MMP Messen oder der Eröffnung des mPTP in menschlichen kardialen Myozyten nach Hypoxie/flussbettfilters, durch Durchflusszytometrie nachgewiesen.
Introduction
Koronarer Herzkrankheit ist die häufigste Todesursache weltweit. Die Therapie der Wahl ist für ischämische Schädigung Reduzierung und Begrenzung Infarkt Größe bei Patienten mit ST-Segment Myokardinfarkt erhöhten rechtzeitige und wirksame myokardialen Reperfusion über primäre perkutane Koronarintervention (PCI)1, 2. Reperfusion verursacht zusätzlichen Schaden, die bis zu 30 Prozent des letzten Infarkt Größe3ausmachen kann. Es ist allgemein anerkannt, dass die mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP) nicht nur zentral in mitochondrialen Schäden und Zelle Tod während Ischämie/Reperfusion (ich / R), sondern ist auch ein konvergierende Ziel kardioprotektive Signalisierung4 , 5. mPTP Eröffnung Depolarisation der inneren mitochondrialen Membran potenzielle (MMP)4bringen würde, wir haben festgestellt, mPTP Eröffnung mit 5, 5 ‘, 6, 6 ‘-Tetrachloro-1, 1, 3, 3′-Tetraethylblei-Imidacarbocyanineiodide (JC-1) Assay.
Die JC-1-Assay ist eine Cytofluorimetric Methode, die sowohl quantitative als auch qualitative, und es wurde weiter durch die Analyse der MMP auf der Ebene eines einzelnen Mitochondrien6validiert. JC-1 existiert als aggregierter Form, eine rote bis orange farbigen Emission (590 ± 17,5 nm) in der Matrix der Mitochondrien mit normalen MMP nachgeben; mit dem Verlust von MMP ist JC-1 in monomerer Form konvertiert, die grünen Fluoreszenz mit einer Emission von 530 nm ± 15 ergibt. Daher deutet eine Abnahme in der rot/grünen Fluoreszenz Intensitätsverhältnis den Rückgang von MMP Bedingungen wie Ischämie/Reperfusion (ich / R).
MMP ist neben JC-1 auch mit Membran durchlässig lipophilen kationen wie Rhodamin 123 und 3, 3′-Dihexyloxadicarbocyanine Jodid [DiOC6(3)] untersucht worden. JC-1 ist jedoch im Vergleich zu diesen zwei Sonden, zuverlässiger für die Analyse von MMP. Rhodamin 123 hat relativ schlechte Sensitivität (insbesondere Quench Modus7,8) und schlechte Spezifität. Die Verschiebung der Rhodamin 123 ist manchmal so klein, dass es schwer für Forscher oder Ausrüstung zu beobachten/zu erkennen. Außerdem in einer einzelnen Zelle, gibt es verschiedene Mitochondrium Bindungsstellen für Rhodamin 123 und so, daß es eventuell unterschiedliche Fluoreszenz Emissionen9. DiOC6(3) wird nicht empfohlen für die Erkennung von MMP entweder so, wie es sensibel auf die Depolarisation der Plasmamembran10 reagiert.
Deshalb verwenden wir hier die JC-1-Assay MMP HCMs bewerten nach Hypoxie/flussbettfilters mit oder ohne einem Schutzmittel ausgesetzt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die JC-1 Farbstoff verwendet, um die MMP der Zellen beurteilen nach der Belichtung H/R. erkannt durch JC-1-Assay, der MMP der Zellen ist unabhängig von Faktoren wie mitochondriale Größe, Form und Dichte, die Einkomponenten-Fluoreszenz beeinflussen können 14-Signale. Infolgedessen sind die Ergebnisse der JC-1-Assay relativ zuverlässig. Außerdem ist es bequem und zeitsparend, JC-1-Assay durchzuführen. Dieser Test hat eine niedrige Anforderung für Materi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der nationalen Schlüssel Forschung und Entwicklung-Programm von China (Nr. 2017YFC1700503), die nationale Basic Research Program (973-Programm) von China (No.2012CB518602), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81370223 und Nr. 81573957), und die Doktoranden Innovative Research Foundation of Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
