Ett flöde flödescytometri-baserad analys för att mäta mitokondriella membranet Potential i hjärt myocyter efter hypoxi/Reoxygenation
Summary
Här presenterar vi ett protokoll som använder JC-1 färgämne för att utvärdera mitokondriella membranet potential celler efter att utsättas för hypoxi/reoxygenation med eller utan en skyddande agent.
Abstract
Snabbt och effektivt reperfusion av ockluderad kranskärl är den bästa strategin för att minska hjärtinfarkt storlek hos patienter med en ST-segmentet förhöjda hjärtinfarkt. Reperfusion i sig. dock kan leda till ytterligare hjärtmuskelcellen döden, ett fenomen som kallas reperfusionsskada. Öppnandet av mitokondriell permeabilitet övergången pore (mPTP), med minskning av den mitokondriella membranpotentialen (MMP) eller mitokondrie depolarisation, är allmänt erkänd som det sista steget av reperfusionsskada och ansvarar för mitokondriella och hjärtmuskelcellen död. JC-1 är en lipofila katjonaktiva färgen som ackumuleras i mitokondrier beroende på MMP värde. Ju högre MMP är, desto mer JC-1 ackumuleras i mitokondrierna. De ökande mängder JC-1 i mitokondrier kan reflekteras av en fluorescens utsläpp övergång från green (~ 530 nm) till rött (~ 590 nm). Därför, minskning av röd/grön fluorescens intensitet förhållandet kan indikera depolarisation av mitokondrier. Här, tar vi fördel av JC-1 att mäta MMP eller öppnandet av mPTP i mänskliga hjärt myocyter efter hypoxi/reoxygenation, upptäcks av flödescytometri.
Introduction
Kranskärlssjukdom är den ledande dödsorsaken i världen. Behandling av valet är för att minska ischemisk skada och begränsa infarct storlek hos patienter med ST-segmentet förhöjda hjärtinfarkt lägligt och effektivt myokardischemi reperfusion via primär perkutan koronar intervention (PCI)1, 2. Men orsakar reperfusion ytterligare skador, som kan stå för upp till 30 procent av det slutliga infarct storlek3. Det är allmänt erkänt att mitokondriell permeabilitet övergången pore (mPTP) inte är bara centrala i mitokondriell skada och cell död under ischemi/reperfusion (jag / R), men är också ett konvergerande mål av hjärtskyddande signalering4 , 5. som mPTP öppningen skulle medföra depolarisation av inre mitokondriella membranet potential (MMP)4, vi upptäckt mPTP öppning använder 5, 5 ‘, 6, 6 ‘-Tetrachloro-1, 1′, 3, 3 ‘-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) analys.
JC-1 analysen är en cytofluorimetric metod som är både kvalitativa och kvantitativa, och den ytterligare har verifierats genom att analysera MMP i nivå med en enda mitokondrier6. JC-1 finns som aggregerad form, vilket ger en röd-orange färgade utsläpp (590 ± 17,5 nm) i matrisen av mitokondrier med normala MMP; med förlusten av MMP konverteras JC-1 till monomera form som ger grön fluorescens med utsläpp av 530 ± 15 nm. Därför en minskning i förhållandet röd/grön fluorescens intensitet kan tyda på en minskning av MMP i villkor såsom ischemi/reperfusion (jag / R).
Förutom JC-1, har MMP också undersökts med membran-permeable lipofila katjoner såsom rodamin 123 och 3, 3 ‘-dihexyloxadicarbocyanine jodid [DiOC6(3)]. Men är jämfört med dessa två sonder, JC-1 mer tillförlitlig för att analysera MMP. Rodamin 123 har relativt dålig känslighet (speciellt i snabbkylning läge7,8) och dålig specificitet. Förskjutningen i rodamin 123 är ibland så liten att det är svårt för forskare eller utrustning att observera/upptäcka. Förutom, i en enda cell, det finns olika mitokondrien bindningsställen för rodamin 123 och så att det kan ha olika fluorescens utsläpp9. DiOC6(3) rekommenderas inte för att upptäcka MMP antingen som det reagerar känsligt på depolarisation av plasmamembranet10.
Därför, här använder vi JC-1 analysen för att bedöma de MMP av HCMs efter att utsättas för hypoxi/reoxygenation med eller utan en skyddande agent.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll som använder JC-1 färgämne för att bedöma MMP celler efter att utsättas för H/R. upptäcks av JC-1 assay, MMP av celler är oberoende av faktorer såsom mitokondriell storlek, form och densitet som kan påverka single-komponent fluorescens signaler14. Följaktligen är resultaten av JC-1 analysen relativt tillförlitliga. Dessutom är det praktiskt och tidsbesparande att utföra JC-1 analysen. Denna analys har låga krav på material och reagenser, och gene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från den nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (nr. 2017YFC1700503), nationella grundläggande forskningsprogrammet (973 Program) Kina (No.2012CB518602), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr. 81370223 och nr 81573957), och de doktorander innovativa Research Foundation i Peking unionen Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
References
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
- Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
- Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
- Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , 14 (2001).
- Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
- Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775 (2017).
- Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
- Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
- Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
- Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065 (2017).
- Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
- Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
- Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
- Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
- Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
- Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
- El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105 (2017).
- Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).
