Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

Summary

여기, 선물이 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 세포의 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜.

Abstract

관상동맥 폐색된의 신속 하 고 효율적인 reperfusion ST 세그먼트를 가진 환자에서 심근 경색 크기를 감소에 대 한 최선의 전략 상승 심근 경색 이다. 그러나, reperfusion 라기보다 발생할 수 있습니다 추가 cardiomyocyte 죽음, reperfusion 상해로 알려진 현상. (MMP), 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 감소와 미토 콘 드리 아의 도발은 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 공 (mPTP)의 오프닝 reperfusion 상해의 마지막 단계로 보편적으로 인식 되 고에 대 한 책임은 미토 콘 드리 아와 cardiomyocyte 죽음. JC-1 MMP의 값에 따라 미토 콘 드리 아에서 축적 되는 질 성 양이온 염료 이다. MMP, JC-1는 미토 콘 드리 아에서 축적 하는 더 높은. 미토 콘 드리 아에서 JC-1의 증가 금액에서 녹색 형광 방출 변화에 의해 반영 될 수 있다 (~ 530 nm) 빨강 (~ 590 nm). 따라서, 빨강/녹색 형광 강렬 비율의 감소는 미토 콘 드리 아의 도발은 나타낼 수 있습니다. 여기, 우리 걸릴 JC-1 MMP, 측정을 활용 또는 산소/reoxygenation, cytometry에 의해 감지 후 인간의 심장 myocytes에서 mPTP의 오프닝.

Introduction

관상 동맥 심장 질환 죽음은 전세계의 주요 원인입니다. 치료의 선택의 허 혈 성 상해를 줄이고 ST 세그먼트를 가진 환자에서 경색 크기 제한 상승 심근 경색 주 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI)^{1를 통해 신속 하 고 효과적인 심근 reperfusion는 2}. 그러나, reperfusion 최종 경색 크기³의 30%를 위한 계정을 수 있습니다 추가 손상이 발생 합니다. 그것은 보편적으로 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 공 (mPTP)가 뿐만 아니라 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 동안 미토 콘 드 리아 손상과 세포 죽음에 중앙 인정 (I / R), cardioprotective 신호⁴ 의 수렴 대상 이기도 하지만 ^{, 5}. 우리 mPTP 오프닝 5 ‘, 5를 사용 하 여 감지 mPTP 오프닝 안 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)⁴의 도발은 대해가지고 것, 6, 6 ‘-Tetrachloro-1, 1, 3, 3 ‘-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) 분석 결과.

JC-1 분석 결과 cytofluorimetric 메서드를 질적, 양적, 그리고 단일 미토 콘 드리 아⁶의 수준에서 MMP를 분석 하 여 추가 검증 되었습니다. JC-1 오렌지 색깔된 방출에 (590 ± 17.5 nm) 매트릭스에서 정상적인 MMP;와 미토 콘 드리 아의 빨간색 저조한, 집계 된 형태로 존재 MMP의 손실, JC-1 530 ± 15 nm의 방출 함께 녹색 형광을 생성 하는 단위체 양식으로 변환 됩니다. 따라서, 빨강/녹색 형광 강렬 비율 감소 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 같은 조건에서 MMP의 감소를 나타낼 수 있습니다 (I / R).

JC-1, 이외에 MMP Rhodamine 123 등 3, 3 ‘-dihexyloxadicarbocyanine 요오드 화물 [DiOC6(3)] 막 투과성 질 성 양이온으로 공부도 했다. 그러나, 이러한 두 프로브에 비해, JC 1 MMP를 분석 하기 위한 더욱 안정적입니다. Rhodamine 123 (특히 냉각 모드^7,8)에서 상대적으로 빈약한 감도 있으며 가난한 특이성. Rhodamine 123에에서 변화 때로는 작습니다 그래서 그것은 관찰/감지 하 연구원 또는 장비에 대 한 하드. 게다가, 단일 셀에서 rhodamine 123에 대 한 다른 mitochondrion 바인딩 사이트 하 고 그래서 그것이 다른 형광 방출⁹있을 수 있습니다 키를 누릅니다. DiOC6(3) MMP 감지에 대 한 권장 하지 않습니다도 플라즈마 막¹⁰의 도발은에 민감하게 반응 하는 그것.

따라서, 여기에 우리가 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 HCMs MMP를 평가 하기 위해 JC-1 분석 결과 사용 합니다.

Protocol

1입니다. 시 약 및 솔루션의 준비 제조업체의 지침에 따라 Myocyte 성장 매체의 500 ml Myocyte 성장 매체 보충 믹스의 25 mL를 추가 하 여 인간의 심장 myocytes (HCMs) 완전 한 매체를 준비 합니다. 4 ° C에서 37 ° c를 사용 하기 전에 따뜻한이. Tongxinluo (광장) 솔루션 준비 혈 청/포도 당-무료 광장 ultrafine 분말을 용 해 하 여 Dulbecco의이 글의 중간 (DMEM)를 수정 하 고 (자세한 내용은 참조<sup class="xref…

Representative Results

MMP의 변화를 평가 하기 위해 JC-1 분석 결과 수행 하기 전에 실험 실시 성공적으로 조건을 확인 하는 연구자에 의해 설정 것이 좋습니다. 정상 그룹에 비해 교류 cytometry 결과 (그림 2)와 같이 산소/reoxygenation (H/R)는 크게 HCMs (Annexin V + /PI±)의 apoptosis 유도 우리 나의 세포 기반 모델을 설립 했다 나타내는 / R (45.00 ± 2.13 %vs. 11.50 p 일반 그룹에서 ± 0.1…

Discussion

여기, 선물이 JC-1 분석 결과 의해 H/R. 검색에 노출 되 고 후 셀의 MMP를 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜, 세포의 MMP는 미토 콘 드리 아의 크기, 모양, 및 형광 단일 구성 요소에 영향을 미칠 수 밀도 같은 요인의 독립 ¹⁴신호. 따라서, JC-1 분석 결과의 결과 상대적으로 안정적 이다. 게다가, 그것은 편리 하 고 JC-1 시험 수행에 시간 절약입니다. 이 분석 결과 재료 및 시 ?…

Materials

Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Beyodtime, China	C2006	In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM)
Tongxinluo ultrafine powder	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China	071201
Annexin V-FITC/PI Kit	Becton-Dickinson, USA	556547
DMEM	Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA	11966-025
Human cardiac myocyte	Promocell, Germany	C-12810
Myocyte Growth Medium (SupplementMix)	Promocell, Germany	C-39275
Myocyte Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell, Germany	C-22070	used with Myocyte Growth Medium SupplementMix
GENbox	BioMérieux, Marcy l’Etoile, France	96127	2.5L
Catalyst (AnaeroPack)	MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan	C-1
Anaerobic indicator	BioMérieux, Marcy l’Etoile, France	96118
Flow cytometer	Becton-Dickinson, USA	FACSAria 2
BD FACSDiva Software	Becton-Dickinson, USA		Version8.0.1
Sample tube	Corning science, USA	352054	12*75mm
PBS	Hyclone, USA	SH30256.01