जीनोम-Eukaryotic जीवों में प्रतिलेखन त्रुटियों की व्यापक निगरानी
Summary
इस प्रोटोकॉल के एक नए उपकरण के साथ कई मॉडल जीवों में प्रतिलेखन की निष्ठा पर नजर रखने के शोधकर्ताओं प्रदान करता है ।
Abstract
सटीक प्रतिलेखन आनुवंशिक जानकारी के वफादार अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है । आश्चर्य की बात है हालांकि, थोड़ा तंत्र है कि प्रतिलेखन के प्रति निष्ठा नियंत्रण के बारे में जाना जाता है । वैज्ञानिक ज्ञान में इस अंतर को भरने के लिए, हम हाल ही में सर्कल sequencing परख Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, और Caenorhabditis के transcriptome भर में प्रतिलेखन त्रुटियों का पता लगाने के लिए अनुकूलित एलिगेंस। इस प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली नए उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए eukaryotic कोशिकाओं में प्रतिलेखन त्रुटियों के परिदृश्य नक्शा इतना है कि तंत्र है कि प्रतिलेखन के प्रति निष्ठा नियंत्रण अभूतपूर्व विस्तार में आविर्भाव किया जा सकता है ।
Introduction
जीनोम जीवन का एक सटीक जैविक खाका प्रदान करता है । इस खाका को सही ढंग से लागू करने के लिए, यह जीनोम के लिए महत्वपूर्ण है महान परिशुद्धता के साथ लिखित हो । हालांकि, प्रतिलेखन त्रुटि मुक्त होने की संभावना नहीं है । उदाहरण के लिए, आरएनए polymerases लंबे इन विट्रो1,2में त्रुटि प्रवण होने के लिए ज्ञात किया गया है, और हाल ही में यह दिखाया गया था कि वे vivo में त्रुटियों के रूप में अच्छी तरह से3,5,6, विशेष रूप से जब डीएनए क्षति के साथ सामना7,8,9,10। एक साथ ले लिया, इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि प्रतिलेखन त्रुटियों सभी जीवित कोशिकाओं में लगातार होते हैं, सुझाव है कि वे रूपांतरित प्रोटीन का एक शक्तिशाली स्रोत हो सकता है ।
यह प्रक्रिया, शब्द transcriptional mutagenesis, दो मायनों में शास्त्रीय mutagenesis से अलग है । पहले, आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के विपरीत, प्रतिलेखन त्रुटियों दोनों mitotic और पोस्ट-mitotic कोशिकाओं को प्रभावित, के रूप में वे डीएनए प्रतिकृति पर निर्भर नहीं है । तंत्र का अध्ययन है कि प्रभाव प्रतिलेखन की निष्ठा, इसलिए होगा, दोनों mitotic और पोस्ट-mitotic कोशिकाओं के उत्परिवर्तन लोड में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । दिलचस्प है, प्रतिलेखन त्रुटियों को हाल ही में प्रोटीन एकत्रीकरण11,12,13 के संवर्धन में फंसाया गया है और दोनों कैंसरजनन10 और में योगदान करने के लिए परिकल्पना की गई है बैक्टीरिया14में एंटीबायोटिक प्रतिरोध का विकास ।
दूसरा, आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के विपरीत, प्रतिलेखन त्रुटियों प्रकृति में क्षणिक हैं । उनके अस्थाई अस्तित्व विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह प्रतिलेखन त्रुटियों का पता लगाने के लिए बेहद मुश्किल बना देता है । उदाहरण के लिए, जबकि कई प्रयोगशालाओं transcriptional mutagenesis के अध्ययन के लिए मूल्यवान रिपोर्टर परख तैयार की है, इन परख केवल संदर्भों और मॉडल जीवों की एक सीमित संख्या में प्रतिलेखन त्रुटियों को मापने के लिए कर रहे है4,15। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, कई शोधकर्ताओं ने आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी (आरएनए-seq) को बदल दिया है, जो सैद्धांतिक रूप से प्रतिलेखन त्रुटियों को किसी भी प्रजाति के transcriptome भर में दर्ज करने की अनुमति देता है । हालांकि, इन अध्ययनों से आसानी से ऐसे रिवर्स प्रतिलेखन त्रुटियों, पीसीआर प्रवर्धन त्रुटियों के रूप में पुस्तकालय निर्माण कलाकृतियों, द्वारा स्थापित कर रहे हैं, और खुद को अनुक्रमण की त्रुटि प्रवण प्रकृति । उदाहरण के लिए, रिवर्स transcriptases हर ~ २०,००० कुर्सियां लगभग एक त्रुटि प्रतिबद्ध है, जबकि आरएनए polymerases (RNAPs) केवल एक त्रुटि हर ३००,००० कुर्सियां5,6बनाने की उंमीद कर रहे हैं । क्योंकि रिवर्स प्रतिलेखन की त्रुटि दर अकेले आरएनए polymerases कोशिकाओं के अंदर की त्रुटि दर बौने, यह वस्तुतः पारंपरिक आरएनए-Seq डेटा में पुस्तकालय की तैयारी की वजह से कलाकृतियों से सच प्रतिलेखन त्रुटियों को अलग करने के लिए असंभव है ( चित्र 1a) ।
इस समस्या को हल करने के लिए, हम सर्कल के एक अनुकूलित संस्करण-sequencing (Cirseq, या सी-seq) परख5,16विकसित की है । इस परख उपयोगकर्ता प्रतिलेखन त्रुटि और अंय transcriptome5भर में आरएनए में दुर्लभ वेरिएंट का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । परिपत्र अनुक्रमण परख इस नाम किया जाता है क्योंकि इस परख में एक महत्वपूर्ण कदम आरएनए circularization के आसपास घूमती है । एक बार आरएनए लक्ष्य परिपत्रित कर रहे हैं, वे रिवर्स एक रोलिंग सर्कल फैशन में प्रतिलिखित हैं, रैखिक सीडीएनए अणुओं है कि एक ही आरएनए टेम्पलेट की कई प्रतियां शामिल उत्पादन करने के लिए. यदि कोई त्रुटि इन टेंपलेट्स में से एक में मौजूद था, यह त्रुटि भी सीडीएनए अणु के भीतर समाहित हर एक दोहराने में मौजूद होगा । इसके विपरीत, त्रुटियों रिवर्स प्रतिलेखन, पीसीआर प्रवर्धन, या अनुक्रमण द्वारा शुरू की बेतरतीब ढंग से पैदा करते हैं, और इस प्रकार केवल एक या दो दोहराने में मौजूद हो जाएगा । इस प्रकार, प्रत्येक सीडीएनए अणु के लिए एक आम सहमति अनुक्रम पैदा करके, और त्रुटियों कि सभी दोहराता में पाए जाते हैं, पुस्तकालय निर्माण कलाकृतियों प्रभावी ढंग से सही प्रतिलेखन त्रुटियों (आंकड़ा 1b) से अलग किया जा सकता से यादृच्छिक त्रुटियों भेद ।
यदि ठीक से इस्तेमाल किया, सी-seq परख सही आधार प्रतिस्थापन, सम्मिलन, और किसी भी प्रजाति के transcriptome भर में आरएनए में हटाने की दर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, ट्रैवर्स और Ochman17देखें). उदाहरण के लिए, हम सी-seq परख का इस्तेमाल किया है Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, और एक आधार संकल्प 5 के साथ Caenorhabditis एलिगेंस में प्रतिलेखन की त्रुटि दर की जीनोम चौड़ा माप प्रदान (अप्रकाशित प्रेक्षणों) । मूलतः के लिए सही अनुक्रम आरएनए वायरस आबादी का इस्तेमाल किया, सी के इस अनुकूलित संस्करण-seq परख पुस्तकालय की तैयारी है कि पुस्तकालय निर्माण कलाकृतियों के लिए योगदान के दौरान कठोर शर्तों को कम करने के लिए सुव्यवस्थित किया गया है । इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के एक नंबर का उपयोग करके, परख का प्रवाह बहुत सुधार हुआ है, साथ ही साथ अपने उपयोगकर्ता मित्रता । अगर ठीक से इस्तेमाल किया, इस परख सही नकल प्रति प्रतिलिपि त्रुटियों के हजारों का पता लगाने के कर सकते हैं, जिससे बहुत पिछले अध्ययन6पर सुधार । कुल मिलाकर, इस विधि transcriptional mutagenesis अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है और उपयोगकर्ता तंत्र है कि जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रतिलेखन की निष्ठा पर नियंत्रण में उपंयास अंतर्दृष्टि हासिल करने की अनुमति देगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, और Caenorhabditis एलिगेंसमें प्रतिलेखन त्रुटियों का पता लगाने के लिए सी-seq पुस्तकालयों की तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल मौजूदा प्रोटोकॉल पर क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रकाशन को अनुदान T32ES019851 (सी. Fritsch), R01AG054641, और एक अफर युवा अन्वेषक अनुदान (एम. Vermulst) से वित्त पोषण द्वारा संभव बनाया गया था.
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
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