Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim
Summary
Bu iletişim kuralı birden çok model organizmalar transkripsiyon kalitesini izlemek için araştırmacılar ile yeni bir araç sağlar.
Abstract
Doğru transkripsiyon genetik bilgi sadık ifade için gereklidir. Rağmen şaşırtıcı derecede az transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları hakkında bilinir. Bilimsel bilgi bu boşluğu doldurmak için biz son zamanlarda daire-sıralama tahlil Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis transcriptome boyunca transkripsiyon hataları tespit etmek için en iyi duruma getirilmiş elegans. Bu iletişim kuralı böylece transkripsiyon kalitesini kontrol mekanizmaları benzersiz detay aydınlatılmamıştır ökaryotik hücrelerde transkripsiyon hataları peyzaj eşlemek için araştırmacılar ile yeni ve güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Genom kesin bir biyolojik plan yaşam sağlar. Bu plan doğru çözümü için büyük bir kesinlikle transkripsiyonu genom önemlidir. Ancak, transkripsiyon hatasız olması pek mümkün değildir. Örneğin, RNA polimeraz hataya vitro1,2olmak uzun bilinmektedir ve son zamanlarda onlar3,5,6yanı sıra hataları vivo içinde işlemek gösterildi, zaman özellikle DNA hasar7,8,9,10ile karşı karşıya. Birlikte ele alındığında, bu gözlemler transkripsiyon hataları sürekli onlar mutasyona uğramış proteinlerin güçlü bir kaynak olabilir düşündüren tüm canlı hücrelerde meydana gösterir.
Transkripsiyon mutagenesis olarak adlandırılan bu işlem iki yolla klasik mutagenesis farklı. İlk olarak, DNA ikileşmesi üzerinde bağımlı oldukları değil gibi genetik mutasyonlar aksine mitotik ve sonrası Mitotik hücre, transkripsiyon hataları etkiler. Transkripsiyon kalitesini etki mekanizmaları eğitim bu nedenle, mitotik ve sonrası Mitotik hücre mutasyon yük içine değerli bilgiler sağlar. İlginçtir, transkripsiyon hataları son zamanlarda protein toplama11,12,13 promosyona karıştığı olmuştur ve her iki karsinojenezis10 ‘ a katkıda onaylanmadığına karar ve antibiyotik direnci bakteriler14geliştirilmesi.
İkinci olarak, genetik mutasyonlar aksine transkripsiyon doğada geçici hatalardır. Geçici varlıklarını özellikle zor çünkü transkripsiyon hataları tespit etmek son derece zor hale getirir. Birkaç labs değerli muhabir deneyleri transkripsiyon mutagenesis incelenmesi için tasarladılar, örneğin, bu deneyleri sadece sınırlı sayıda bağlamları ve model organizmalar4,15transkripsiyon hataları ölçmek mümkün iken. Bu sınırlamalarını aşmak için birçok araştırmacılar RNA sıralama teknolojisi (RNA-seq) teorik olarak herhangi bir tür transcriptome kaydedilecek transkripsiyon hataları sağlar için döndü. Ancak, bu çalışmalar kolayca Ters transkripsiyon hataları, PCR güçlendirme hataları ve kendisi sıralama hataya doğası gibi Kütüphane İnşaat yapılar tarafından şaşırmış. Örneğin, RNA polimeraz (RNAPs) her 300.000 bazlar5,6yalnızca bir hata yapmak için beklenen süre ters transcriptases her ~ 20.000 bazlar, yaklaşık bir hata işlemek. Hata oranı Ters transkripsiyon yalnız RNA polimeraz hücreleri içinde hata oranı cüceler çünkü geleneksel RNA-Seq veri ( Kütüphane hazırlanmasında neden eserler gerçek transkripsiyon hataları ayırmak neredeyse imkansız olduğunu Şekil 1a).
Bu sorunu çözmek için tahlil5,16daire sıralama (Cirseq veya C-seq bundan sonra) en iyi duruma getirilmiş bir sürümünü geliştirdik. Bu tahlil transkripsiyon hataları ve diğer nadir türevleri RNA transcriptome5algılamak Kullanıcı sağlar. Bu tahlil önemli bir adım RNA daireselleşmesi döner çünkü daire-sıralama tahlil bu adı taşır. RNA hedefler circularized sonra onlar çok sayıda aynı RNA şablonu kopyalarını içeren doğrusal cDNA molekülleri üretmek için bir haddeleme daire moda, transkripsiyonu ters gelir. Bir hata bu şablonlardan biri varsa, bu hata ayrıca cDNA molekül içinde yer alan her tek tekrar mevcut olacaktır. Buna ek olarak, Ters transkripsiyon, PCR güçlendirme veya sıralama tarafından tanıtılan hataları rastgele ortaya çıkan eğilimindedir ve bu nedenle yalnızca bir veya iki tekrarlar içinde mevcut olacaktır. Böylece, her cDNA molekül için bir fikir birliği sıra oluşturma ve rasgele hatalar tüm tekrarlar içinde oluşan hatalar dan ayırt etme, Kütüphane inşaat yapıları etkili gerçek transkripsiyon hataları (Şekil 1b) ayrılabilir.
Uygun bir şekilde kullanıldığında, C-seq tahlil doğru RNA içinde herhangi bir tür transcriptome temel oyuncu değişikliği, eklemeler ve silmeler oranı tespit etmek için kullanılabilir (örneğin, çapraz ve Ochman17bakınız). Örneğin, bir tek temel çözünürlükte5 genom çapında ölçümleri ve transkripsiyon Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis elegans hata hızı sağlamak için C-seq tahlil kullandık (yayınlanmamış gözlemler). Başlangıçta doğru RNA virüsü nüfus sıralamak için kullanılan, bu en iyi duruma getirilmiş sürümü, C-seq tahlil Kütüphane inşaat yapıları için katkıda sert koşullarına Kütüphane hazırlık sırasında en aza indirmek için düzenlenmiştir. Buna ek olarak, bir dizi ticari olarak mevcut kitleri kullanarak, tahlil-den geçerek büyük ölçüde, yanı sıra kendi user-friendliness artırıldı. Uygun bir şekilde kullanıldığında, bu tahlil doğru bir şekilde yapar, böylece önemli ölçüde önceki çalışmalar6tarihinde iyileştirilmesi başına transkripsiyon hataları binlerce algılayabilir. Genel olarak, bu yöntem transkripsiyon mutagenesis çalışmak için güçlü bir araç sağlar ve transkripsiyon organizmalar geniş bir alanda kalitesini kontrol mekanizmaları yeni anlayışlar kazanmak kullanıcının izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, transkripsiyon hataları Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterve Caenorhabditis eleganstespiti için C-seq kitaplıkları hazırlanması için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının varolan iletişim kuralları, aynı zamanda alternatif teknikleri üzerinde çok sayıda avantajı vardır.
Son 15 yılda çok sayıda gazeteci sistemleri bu luciferase7,8…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayın (C. Fritsch) hibe T32ES019851 fon tarafından mümkün yapıldı, R01AG054641 ve AFAR genç araştırmacı (M. Vermulst) verin.
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
