البرد الشبكية-الفروع، الجامع--يتصاعد، والتحضيرات ناقص التوتر المفرج معزولة للتصور المناعي من بيريسيتيس ميكروفاسكولار
Summary
علينا أن نظهر ثلاث تقنيات إعداد الأنسجة المختلفة للتصور المناعي للفئران بيريسيتيس microvascular الشبكية و أي البرد-أقسام والجامع–يتصاعد والعزلة ناقص التوتر لشبكة الأوعية الدموية.
Abstract
بيريسيتيس الشبكية دوراً هاما في العديد من أمراض العين. المناعي تلطيخ التقنيات الشبكية السفن وميكروفاسكولار بيريسيتيس المركزي لبحوث طب العيون. من المهم أن تختار طريقة مناسبة لتصور بيريسيتيس ميكروفاسكولار. يصف لنا بيريسيتي ميكروفاسكولار الشبكية المناعي تلطيخ في البرد-أقسام وكل–يتصاعد وناقص التوتر المفرج المعزولة باستخدام الأجسام المضادة لعوامل النمو المشتقة من الصفيحات مستقبلات بيتا (PDGFRβ) والأعصاب/الدبقية مستضد 2 (NG2). وهذا يسمح لنا لتسليط الضوء على مزايا وعيوب كل من الأعمال التحضيرية ثلاثة أنسجة لتصور بيريسيتيس ميكروفاسكولار الشبكية. Cryo-أقسام تقديم التصور ترانسيكشونال من جميع طبقات الشبكية لكن تحتوي على إلا عدد قليل من التخفيضات عرضية عرضية ميكروفاسكولاتوري. الجامع-جبل يوفر لمحة عامة عن المفرج الشبكية كاملة، ولكن التصور ميكروفاسكولاتوري يمكن أن تكون مزعجة. ناقص التوتر العزل يوفر طريقة لتصور المفرج الشبكية كاملة بإزالة الخلايا العصبية، ولكن هذا يجعل الأنسجة هشة للغاية.
Introduction
بيريسيتيس الشبكية هي تركيز العديد من مختبرات الأبحاث هذه الخلايا تلعب دوراً كبيرا في سلامة المفرج. الحالات المرضية مثل اعتلال الشبكية السكري1والاسكيمية2و3 من الزرق بخصائص الأوعية الدموية التي تنطوي على وظيفة بيريسيتيس. تم العثور على بيريسيتيس في بليكسوسيس الشعرية الشبكية الداخلية. وفروع الشريان الشبكية المركزية التي تزود الشبكية الداخلية في طبقتين من بليكسوسيس الشعرية. سرير الأوعية الداخلية يقع بين الخلية العقدة وطبقات النووية الداخلية. طبقة أعمق أكثر كثافة وتعقيداً وهو مترجم بين طبقات النووي الداخلي والخارجي4،5. وبالإضافة إلى ذلك، تحتوي بعض أجزاء من الشبكية أيضا على شبكة ثالثة تسمى الشعيرات الدموية بارابابيلاري شعاعي. هذه طويلة، مستقيم الشعيرات الدموية التي تقع بين الألياف العصبية ونادراً ما أناستوموسي مع بعضها البعض أو بليكسوسيس اثنين الأخرى6. داخل الجدار الشعرية، بيريسيتيس المضمنة في الغشاء الطابق السفلي وخط على الجانب أبلومينال من الخلايا البطانية في الأوعية الدموية.
وحتى الآن، هناك لا علامة بيولوجية فريدة من نوعها لهذه بيريسيتيس التي يمكن تمييزها عن غيرها من الخلايا والأوعية الدموية. عامل النمو المشتقة من الصفيحات مستقبلات بيتا (PDGFRβ) والأعصاب/الدبقية مستضد 2 (NG2) هي علامات شائعة الاستخدام الذي يقدم في بيريسيتيس ولكن أيضا غيرها من الخلايا والأوعية الدموية. تحديد بيريسيتيس تعقيداً بسبب وجود مجموعات فرعية بيريسيتي التي تختلف في التعبير مورفولوجيا والبروتين7. تعتمد حاليا، تحديد أفضل مزيج من علامات البروتين وتحديد المواقع المميزة من بيريسيتي في جدار الأوعية الدموية. علينا أن نظهر هنا ثلاث تقنيات إعداد الأنسجة المختلفة للمناعي تلطيخ PDGFRβ/NG2 بيريسيتيس microvascular الشبكية الفئران، أي، cryo-أقسام، الجامع–يتصاعد، وناقص التوتر العزلة شبكة الأوعية الدموية.
مع البرد-المقاطع، يتم قطع الشبكية والصلبة عن طريق العصب البصري. وهذا يسمح للتصور من جميع هياكل طبقات من الخلايا العصبية. طبقات الشبكية عشرة متميزة الظاهر كجانب تتبادل الهياكل النووية ومحواري/الجذعية التي يمكن تصور مع بقع مثل الهيماتوكسيلين/ويوزين أو الفلورسنت النووية 4 ‘, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)8. تختلف متطلبات الأيض بين طبقات9 وأنه يوفر طريقة لتحديد سمك أو إجمالي غياب طبقة معينة (مثلاً، فقدان خلايا الشبكية العقدة إحدى السمات المميزة الاسكيمية الشبكية10، 11). ويتضح المفرج كما عرضية يخترق الشبكية، مما يجعل من الممكن لدراسة كل على حدة بليكسوسيس الشعرية داخل طبقات الشبكية كل منهما12،13.
أكثر تقليديا، تجري التحقيقات المتعلقة بشبكة الاتصال الشبكية المفرج في الشبكية كل–يتصاعد. مع هذا الإعداد الأنسجة، قطع شبكية العين وسويت بالأرض كبنية على شكل زهرة. الأسلوب هو أسلوب إعداد أنسجة سريعة نسبيا التي يمكن أن تسلط الضوء على المفرج الشبكية الشاملة في الهندسة المعمارية وذلك كثيرا ما تطبق في تحقيق نيوفاسكولاريزيشن في الشبكية موريني. التصور الناجح من ميكروفاسكولاتوري في الجامعة التي شنت شبكية العين يقال أيضا في وضع الماوس الولدان والفئران الشبكية14،،من1516،،من1718، 19-تكشف هذه الدراسات نشاطا بيريسيتيك أكثر تحديداً مع أكبر المناطق الخالية من شعري في الكبار مقارنة ب المواليد الشبكية14.
هو طريقة أخرى لتصور ميكروفاسكولاتوري الشبكية بعد عزلة ناقص التوتر. نتائج هذا الأسلوب إعداد الأنسجة في الأوعية الدموية الشبكية والشعيرات الدموية سراحهم من الخلايا العصبية. عادة هذا النوع من التصوير ثنائي الأبعاد لشبكة الأوعية الدموية الشبكية معزولة المنجزة بعد التربسين الشبكية الهضم20 والمستخدمة لتقييم تشوهات الأوعية الدموية اعتلال الشبكية السكري بما في ذلك فقدان بيريسيتي والشعرية تنكس20،،من2122. ويوفر طريقة العزل ناقص التوتر التحقيقات الجينات الأوعية الدموية الشبكية والاستجابات التنظيمية البروتين كما فعلوا مع RT-PCR وغرب النشاف23،،من2425. نحن نقدم هنا بروتوكولا لتلطيخ المناعي التعويم الحر للمفرج الشبكية معزولة ناقص التوتر كبديل الهضم التربسين لدراسة بيريسيتيس ميكروفاسكولار.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نقدم ثلاث تقنيات إعداد الشبكية التي يمكن تطبيقها في دراسة ميكروفاسكولار بيريسيتيس الشبكية. فيما يلي، نقدم مقارنة بين كل من الطرق وتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة في البروتوكولات.
مع تقطيع البرد، هو قطع الشبكية في أقسام السهمي و ومن ثم فإنه من الممكن الحصول على عينات عد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الأبحاث بتمويل من مؤسسة Lundbeck، الدانمرك.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
References
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., Lagali, N., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy – Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte?. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
