हमारा लक्ष्य कैंसर रोगियों में थकान से जुड़ी mitochondrial शिथिलता का मूल्यांकन करने के लिए एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल विकसित करना था । इस अभिनव प्रोटोकॉल नैदानिक केवल मानक phlebotomy और बुनियादी प्रयोगशाला प्रक्रियाओं को शामिल उपयोग के लिए अनुकूलित है ।
थकान एक आम और दुर्बल हालत है कि सबसे अधिक कैंसर रोगियों को प्रभावित करता है । तारीख करने के लिए, थकान खराब नहीं नैदानिक परीक्षण के साथ विशेषता के लिए होना चाहए इस हालत की गंभीरता को मापने रहता है । यहां हम थका हुआ कैंसर रोगियों से एकत्र PBMCs के mitochondrial समारोह का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन । एक कॉंपैक्ट extracellular फ्लक्स प्रणाली और श्वसन अवरोधकों के अनुक्रमिक इंजेक्शन का उपयोग करना, हम बेसल mitochondrial श्वसन, अतिरिक्त श्वसन क्षमता को मापने के द्वारा PBMC mitochondrial कार्यात्मक स्थिति की जांच की, और ऊर्जा phenotype, जो वर्णन करता है पसंदीदा ऊर्जा मार्ग तनाव का जवाब । ताजा PBMCs मानक phlebotomy का उपयोग नैदानिक सेटिंग में आसानी से उपलब्ध हैं । पूरे इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख जटिल जैव रासायनिक तकनीकों की भागीदारी के बिना कम से 4 घंटे में पूरा किया जा सकता है । साथ ही, हम reproducible डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है एक सामान्यीकरण विधि का वर्णन करें । सरल प्रक्रिया और सामांयीकरण तरीके प्रस्तुत करने के लिए एक ही रोगी और reproducible डेटा है कि समय अंक के बीच की तुलना में संभावित उपचार प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है की पीढ़ी से दोहराया नमूना संग्रह के लिए अनुमति देते हैं ।
थकान एक प्रचलित और चिंताजनक स्थिति है जिसका कैंसर रोगियों के जीवन की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है1. इस तिथि करने के लिए, कैंसर थकान खराब परिभाषित रहता है और केवल रोगियों द्वारा व्यक्तिपरक रिपोर्टिंग पर निर्भर करता है2। इसलिए, नैदानिक सेटिंग3,4में थकान विशेषता के लिए एक आसानी से अनुकूलनीय नैदानिक प्रयोगशाला परीक्षण की पहचान करने के लिए एक तत्काल जरूरत है.
कई अंतर्निहित तंत्र, mitochondria शिथिलता सहित,5थकान पैदा करने के लिए प्रस्तावित किया गया है । Mitochondria बिजलीघर organelles, ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के माध्यम से सेलुलर ऊर्जा की जरूरत के ९५% प्रदान कर रहे हैं, और कैल्शियम सिग्नलिंग, apoptosis, प्रतिरक्षा संकेतन, और अन्य intracellular संकेतन घटनाओं के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा6 . तदनुसार, बिगड़ा mitochondrial ऊर्जा उत्पादन में ऊर्जावान और दोषों थकान में योगदान कर सकते हैं । इस परिकल्पना का समर्थन, पिछले अध्ययनों क्रोनिक थकान सिंड्रोम7के साथ रोगियों में mitochondrial डीएनए में उत्परिवर्तनों मनाया है । हालांकि यह स्पष्ट नहीं है कि क्या थकान के pathophysiological मूल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र या परिधीय ऊतकों, कंकाल की मांसपेशियों के रूप में8,9के भीतर निहित है, वहां वर्तमान में कोई सीधा तरीका सही आकलन है जी, respiring कोशिकाओं में थकान से संबंधित mitochondrial शिथिलता.
mitochondrial समारोह का अध्ययन करने के लिए परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का उपयोग कई लाभ प्रदान करता है । सबसे पहले, PBMCs मानक phlebotomy का उपयोग कर नैदानिक सेटिंग में आसानी से उपलब्ध हैं और जल्दी से बुनियादी प्रयोगशाला तकनीकों का उपयोग कर अलग किया जा सकता है. दूसरा, रक्त संग्रह इस तरह के एक मांसपेशी बायोप्सी के रूप में अन्य ऊतकों को इकट्ठा करने से कम आक्रामक है । इस प्रकार, रक्त के नमूनों को समय के साथ एक ही रोगी के बार से एकत्र किया जा सकता है, जो उपचार प्रभाव के अनुदैर्ध्य आकलन की सुविधा । दिलचस्प है, PBMCs में mitochondrial समारोह में अच्छी तरह से एक पशु मॉडल में गुर्दे mitochondrial स्थिति के साथ संबंधित होना दिखाई दिया10. इसके अलावा, प्रतिरक्षा कोशिका mitochondria अलग रोग की स्थिति11,12के तहत प्रणालीगत परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया गया है । परिसंचारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं में Mitochondria विशेष रूप से प्रतिरक्षा कार्यों में परिवर्तन और प्रतिरक्षा संकेत अणुओं जैसे साइटोकिंस13,14,15के रूप में संवेदनशील होते हैं । उदाहरण के लिए, यह देखा गया है कि तीव्र आमवाती भड़काऊ रोगों के साथ रोगियों से PBMCs उच्च आधारभूत ऑक्सीजन खपत14प्रदर्शन. इसके विपरीत, ऑक्सीजन की खपत पूति16सहित प्रणालीगत भड़काऊ शर्तों के साथ रोगियों से अलग PBMCs में कम किया गया था । भड़काऊ शर्तों के तहत, बेकार mitochondria द्वारा उत्पादित मुक्त कण आगे ऑक्सीडेटिव तनाव और लंबे समय तक सूजन17में योगदान कर सकते हैं । ऊर्जा उत्पादन में mitochondria की केंद्रीय भूमिका के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऑक्सीडेटिव तनाव कैंसर रोगियों में थकान का अध्ययन करने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में mitochondrial समारोह का उपयोग कर के संभावित उपयोगिता पता चलता है 13।
पिछले mitochondrial समारोह का परीक्षण अध्ययन जैव रासायनिक तकनीक का उपयोग किया, mitochondrial झिल्ली संभावित माप, या विशिष्ट कोशिका आबादी के अलगाव कि नैदानिक सेटिंग5में आसानी से अनुकूलनीय नहीं हो सकता है, 14,18. हाल के वर्षों में, extracellular फ्लक्स परख के विकास के शोधकर्ताओं ने अनुमति दी है आसानी से और सही ऑक्सीजन खपत दर में परिवर्तन की जांच (ओसीआर) श्वसन अवरोधकों के स्वचालित इंजेक्शन के लिए जवाब में,20 , 21 , 22. हालांकि, इनमें से अधिकांश अध्ययनों को विशिष्ट कक्ष प्रकारों के लिए डिज़ाइन किया गया है और बड़े उच्च-प्रवाह स्वरूप एक नैदानिक सेटिंग में लागू नहीं हो सकता है । इस पांडुलिपि में, हम नैदानिक उपयोग के लिए mitochondrial समारोह की जांच के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन ।
कैंसर के रोगियों में थकान एक दुर्बल हालत है कि अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है या1विशेषता है । थकान का निदान पूरी तरह से व्यक्तिपरक रिपोर्टिंग पर निर्भर करता है और इस हालत के लिए कोई वर्तमान नैदा?…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन के NIH, बेथेस्डा, मैरीलैंड के राष्ट्रीय नर्सिंग अनुसंधान संस्थान के अंदर अनुसंधान के विभाजन द्वारा पूरी तरह से समर्थित है ।
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |