تجزئة سوبسيلولار من العينات المعدية المعوية الطازجة والمجمدة
Summary
نقدم هنا، بروتوكول القيام تجزئة خلوية بسيطة لفصل سوبسيلولار من البروتينات هيولى والنووية في الخزعات المعوية البشرية الطازجة والمجمدة.
Abstract
والغرض من هذا البروتوكول يجزئ الأنسجة المعوية البشرية التي حصل عليها التنظير في المقصورات النووية وهيولي لتحليل التعريب من بروتينات محددة أو مجمعات البروتين في الأنسجة مختلف الدول (أي، صحية مقابل المرض). يعد هذا الأسلوب مفيداً لتجزئة كلا عينات الأنسجة المعوية الطازجة والمجمدة؛ ومن الوصول إليها بسهولة لجميع المختبرات ولا تستغرق وقتاً طويلاً.
Introduction
البروتينات المشاركة في ما يقرب من جميع الوظائف البيولوجية داخل خلية وأي اختلاف في هيكل أو الكمية أو مكان يمكن أن يؤدي إلى سيناريو المسببة للأمراض. أساليب وجود عينة الأنسجة نهجاً مفيداً الحد من تعقيد المرض ذات الصلة بتحليل البروتين. بعض الدراسات استخدام البروتين التعريب المعلومات أو إثراء بروتين من حجرة الهاتف خلوي محددة، ذلك بروتوكول لتجزئة استنساخه من البروتينات سليمة مفيدة للرد على بعض الأسئلة البيولوجية. تحديد الترجمة سوبسيلولار للبروتينات والرصد على إعادة توزيع مقسم أو التفاعلات في القاعدية وظروف المرض سيساعد على تحديد الأمراض المتعلقة بالاختلافات الوظيفية1،2. وبالتالي، يهدف هذا الأسلوب إلى تكاثر يجزئ خزعات الأنسجة المعوية، الطازجة والمجمدة، في مقصورات سوبسيلولار هيولى والنووية على حد سواء.
عينات خزعة الأمعاء بشكل روتيني يتم الحصول عليها من خلال إجراءات التنظير3 (الشكل 1)، ويمكن استخدامه بفعالية لتحديد مقدار البروتين أو الدراسات إيمونوبريسيبيتيشن. سوف تحتوي على عينات الأنسجة من الأمعاء الظهارية البروتينات التي قد تكون ضالعة مباشرة في إمراضية المرض4، عينات خزعة الأمعاء مصدرا قيماً للغاية لتحديد هوية الناجحة الخاصة بالأمراض المعوية البروتينات. عينات الأنسجة المجمدة، والمريض المخزنة جنبا إلى جنب مع المعلومات السريرية موارد مفيدة لتحليل البروتين، وإعداد نموذج بسيط واستنساخه مسألة أساسية لتوفير معلومات الخلية يغلب استخدام المبالغ المقيدة لتجميد 5من الأنسجة.
هناك عدة مجموعات المتاحة تجارياً للفصل بين كسور الخلوية، ولكن هذه أكثر تكلفة وعموما أكثر استهلاكاً للوقت من البروتوكول المعروضة هنا. استناداً إلى بروتوكولات متعددة الخطوات المتدرجة الطرد المركزي وكما استخدمت التدرجات المستمر سابقا لتجزئة المقصورات الخلوية المتنوعة في أنسجة مختلفة6،7. ومع ذلك، الحفاظ على الاتساق بين التدرجات المستمر غالباً ما مهمة صعبة. بروتوكولات مماثلة تستند إلى تحلل متسلسل للأغشية وقد وصفت سابقا ولكن يحتاجون عادة اثنين أو أكثر من المخازن المؤقتة والأيدي في الوقت المحدد هو أطول8 .
عند تجزئة عينات الأنسجة، إلا يغيب عن البال أن النسيج عينات التفاعلات خلية خلية وخلية المصفوفة الحالية التي غير موجودة في الخلايا المستزرعة وهامة عند الشروع في استخراج البروتين. انهيار السليم بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية دون التأثير على نوعية البروتين سيكون عاملاً حاسما في عزل بروتين الأنسجة المعوية9. في هذا البروتوكول، جهات الاتصال خلية خلية وخلية المصفوفة أولاً مكسورة، الإفراج عن الخلايا ويسمح المخزن المؤقت للوصول إلى الخلايا الفردية. لتجنب البروتين-حجرة خلط قبل تجزئة، يجب أن يحدث انهيار الاتصالات دون تغيير سلامة الخلايا أو الأغشية النووية.
سبب إثراء البروتياز المختلفة في مخاطية الأمعاء10، من المهم مراقبة تدهور البروتين أثناء الاستخراج. للحد من تدهور البروتين المحتملة، يجب تضمين مثبط البروتياز متعددة في مخازن استخراج البروتين. بالإضافة إلى ذلك، إذا مقتطفات ذاهبون لاستخدامها لفحوصات الوظيفية، من الضروري لتجنب تمسخ البروتينات أو بروتيوليسيس لأن هذا سوف يسبب خسارة في نشاط البروتين11. ولهذا الغرض، يتم تنفيذ البروتوكول في 4 درجات مئوية وفلوريد فينيلميثيلسولفونيل الطازج (بمسف) يتم إضافة إلى المخازن المؤقتة بتركيز 0.1 مم فقط قبل استخدامها لتمنع كذلك proteolysis نهائية.
هو الخطوة الأولى في وجود خلية اختلال الأنسجة وتحلل الخلية. وكما ذكر سابقا، يتمثل الهدف في تصنيف الخلايا وكسر لهم فتح مع الحد الأدنى من الضرر. يجب أن يكون تجانس عينات الأنسجة المعوية، وتفكيك الخلايا لتحقيق الحد الأقصى من الكسر من غشاء الخلية. في هذا البروتوكول، نستخدم خلاط مدقة يجهز لكسر الأنسجة المعوية الذي هو تجانس في غضون ثوان عن طريق عمل فورتيكسينج عالية السرعة. بعد التجانس، هي المحتضنة خلايا الأنسجة في المخزن مؤقت ناقص التوتر الذي سوف تنفجر غشاء الخلية ولكن سوف تبقى النواة سليمة، تليها إضافة منظفات غير يشوه (نونيل فينوكسيبوليثوكسيليثانول) ودوامه قصيرة لفصل النوى من الكسر هيولى. بعد إزالة السيتوبلازم، غشاء نواة الخلية هو اقتحام حاجز مكثف مع الهز.
طريقة المقدمة هنا هي طريقة مناسبة لتجزئة سوبسيلولار من الخزعات المعوية الطازجة والمجمدة التي تم الحصول عليها خلال المنظار وتتراوح بين 2 و 10 ميكروغرام في الوزن. البروتوكول سهل واستنساخه، ويمكن أن يؤديها باستخدام المعدات المختبرية الأساسية والمواد الكاشفة في أقل من ساعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستخدم بروتوكول الموصوفة هنا لتجزئة النووية وحشوية من الخزعات المعوية. البروتينات المنقاة هي عدم التشويه والتحريف ويمكن استخدامه ليس فقط في تحليل لطخة غربية كما هو مبين في الشكل 2 و 3 ولكن أيضا في الاختبارات التي تتطلب البروتينات مطوية أصلي مثل إيمونوبريسيبيتيشن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف تقر مساعدة لوبيز أندير وميرين تيليتكسيا لتسجيل الفيديو وتحريرها. وتمول ACR زمالة إيكيرباسك ومشروع بحثي من رابطة سيلياكوس دي مدريد (ACM). جرب الممولة من مشروع إيسسيي-PI16/00258 والممول من “الاتحاد الأوروبي” سيطلب/كلية العلوم التربوية “طريقة لجعل أوروبا”. من هو ممول بمنحه مشروع بحوث 2015111068 من “وزارة الصحة إقليم الباسك”. سيبحث و AJM معتمدة بمنح زمالة بريدوكتورال من UPV/اهو وإدارة التعليم في إقليم الباسك، على التوالي.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. . Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. . Protein purification protocols. , (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
