Subcellular fractionering van verse en diepgevroren gastro-intestinale Specimens
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een eenvoudige cellulaire fractionering voor de subcellular scheiding van cytoplasmatische en nucleaire eiwitten in menselijke verse en diepgevroren intestinale biopsieën.
Abstract
Het doel van dit protocol is aan menselijke intestinale weefsels verkregen door endoscopie in nucleaire en cytoplasmatische compartimenten voor de analyse van de lokalisatie van specifieke proteïnen of eiwitcomplexen in verschillende weefsels Staten (dat wil zeggen, gezonde fractionate VS. ziekte). Deze methode is handig voor de versplintering van zowel verse en diepgevroren intestinale weefselsteekproeven; het is gemakkelijk toegankelijk voor alle laboratoria en niet tijdrovend.
Introduction
Eiwitten nemen in bijna alle biologische functies binnen een cel en elke wijziging in hun structuur, de hoeveelheid of de locatie kan leiden tot een pathogene scenario. Weefsel monster fractionering methoden zijn een nuttige benadering naar het verminderen van de complexiteit van ziekte gerelateerde eiwit analyses. Sommige studies gebruik eiwit lokalisatie-informatie of verrijken van een eiwit van een specifieke cellulaire compartiment, zodat een protocol voor reproduceerbare fractionering van intacte eiwitten is nuttig om bepaalde biologische vragen te beantwoorden. Bepalen de subcellular localisatie van eiwitten en het toezicht op hun compartimentaire herverdeling of interacties op basale en ziekten zal helpen bij het identificeren van ziekte gerelateerde functionele verschillen1,2. Dus, wil deze methode reproducibly fractionate intestinale weefsel biopsieën, zowel vers als diepgevroren, in cytoplasmatische en nucleaire subcellular compartimenten.
Intestinale biopsie monsters worden routinematig verkregen tijdens de endoscopie procedures3 (Figuur 1) en effectief kunnen worden gebruikt voor eiwit kwantificering of immunoprecipitation studies. Aangezien weefselmonsters van intestinale epitheliale eiwitten die rechtstreeks kunnen worden betrokken bij de ziekte pathogenese4 bevatten zal, zijn intestinale biopsie monsters een zeer waardevolle bron voor de succesvolle identificatie van intestinale ziekte-specifieke eiwitten. Opgeslagen bevroren, geduldige weefselsteekproeven samen met de klinische informatie zijn nuttige middelen voor eiwit analyse, en een eenvoudige en reproduceerbare monstervoorbereiding is een belangrijke kwestie te informeren cel compartimentaire behulp van beperkende bedragen van bevroren weefsel5.
Er zijn verschillende commercieel beschikbare kits voor de scheiding van cellulaire breuken, maar deze zijn duurder en over het algemeen meer tijd in beslag dan het protocol hier gepresenteerd. Protocollen op basis van meerdere stappen kleurovergang centrifugeren en continu verlopen ook al eerder hebt gebruikt voor de versplintering van diverse cellulaire compartimenten in verschillende weefsels en6,7. Onderhouden van de consistentie van continue verlopen is echter vaak een moeilijke taak. Soortgelijke protocollen op basis van de sequentiële lysis van membranen zijn eerder beschreven maar ze moeten over het algemeen meer dan twee buffers en de handen op tijd is langer8 .
Wanneer van weefselmonsters, niet vergeten dat weefsel monsters huidige cel-cel en cel-matrix interacties die zowel niet aanwezig in gekweekte cellen zijn en belangrijk wanneer u eiwit extractie. De juiste verdeling tussen cellen en extracellulaire matrix zonder de kwaliteit van de eiwitten te beïnvloeden zullen een cruciale factor in de intestinale weefsel eiwit isolatie9. In dit protocol zijn cel-cel en cel-matrix contacten eerst gebroken, het vrijgeven van de cellen en waardoor de buffer te bereiken van de afzonderlijke cellen. Om te voorkomen dat eiwit-vaks mengen vóór fractionering, moet de verdeling van de contactpersonen plaatsvinden zonder dat de integriteit van de cellen of de nucleaire membranen.
Door de verrijking van verschillende proteasen in de intestinale mucosa10is het belangrijk om te controleren de eiwit-afbraak tijdens extractie. Om te minimaliseren van de potentiële eiwit-afbraak, moet meerdere proteaseinhibitor worden opgenomen in de eiwit extractie buffers. Bovendien, als extracten worden gebruikt voor functionele testen gaat, is het essentieel om te voorkomen dat de denaturatie van eiwitten of proteolyse omdat dit leiden een verlies van eiwit activiteit11 tot zal. Voor dit doel, het protocol wordt uitgevoerd bij 4 ° C en verse phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) wordt toegevoegd aan de buffers op een eindconcentratie van 0.1 mM enkel voorafgaand aan het gebruiken om te remmen verder proteolyse.
De eerste stap in cel fractionering is verstoring van de weefsel en lysis van de cel. Zoals eerder vermeld, is het doel om het gedesag van de cellen en breken die ze met minimale schade open. Intestinale weefselsteekproeven moeten worden gehomogeniseerd en de cellen lysed om maximale breuk van de celmembraan. In dit protocol gebruiken we een gemotoriseerde stamper mixer te breken de intestinale weefsel dat is gehomogeniseerd binnen enkele seconden door middel van hoge snelheid vortexing actie. Na homogenisatie, weefselcellen geïncubeerd in een hypotone buffer die zal barsten het celmembraan, maar zal behouden de kernen, gevolgd door toevoeging van een niet-denaturering wasmiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) en een korte vortex te scheiden van de kernen uit de cytoplasmatische afvalfractie. Na de verwijdering van het cytoplasma, is de celmembraan van de kernen barstte in een hypertonic buffer met schudden.
De methode die hier gepresenteerd is een geschikte methode voor de subcellular fractionering van verse en diepgevroren intestinale biopsieën die zijn verkregen tijdens de Endoscopische procedures en bereik tussen 2 en 10 mg in gewicht. Het protocol is gemakkelijk en reproduceerbaar en kan worden uitgevoerd met behulp van elementaire laboratoriumapparatuur en reagentia in minder dan een uur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier beschreven wordt gebruikt voor de nucleaire en cytoplasmatische fractionering van intestinale biopsieën. De gezuiverde eiwitten zijn niet gedenatureerd en kan worden gebruikt, niet alleen in westelijke vlekkenanalyse zoals weergegeven in Figuur 2 en 3 , maar ook in tests vereisen native-gevouwen eiwitten zoals immunoprecipitation, elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) of native polyacrylamide gelelektroforese (pagina).
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs erkennen de hulp van Ander Lopez en Miren Telletxea voor video opnemen en bewerken. ACR is gefinancierd door een beurs Ikerbasque en een onderzoeksproject van de Asociación de Celiacos Madrid (ACM). RGI is gefinancierd door Project ISCIII-PI16/00258 en medegefinancierd door de Europese Unie EFRO/ESF “Een manier om Europa te maken”. IS wordt gefinancierd door een projectsubsidie onderzoek 2015111068 van het Baskische ministerie van volksgezondheid. IRG en AJM worden ondersteund door predoctoraal fellowship subsidies uit de UPV/EHU en het Baskische ministerie van onderwijs, respectievelijk.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. . Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. . Protein purification protocols. , (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
