هنا، نحن نقدم بروتوكولا لتأكيد وجود طفرة نقطة لتشخيص الداء النشواني ترانسثيريتين وراثية، باستخدام Ala97Ser، أن الطفرة المستوطنة الأكثر شيوعاً في تايوان، على سبيل مثال.
الاختبارات الجينية هو الاختبار الأكثر موثوقية ترانسثيريتين وراثية تتعلق بالداء النشواني، وينبغي أن يقوم في معظم الحالات من الداء النشواني ترانسثيريتين (أتتر). ATTR مرض نادر ولكن قاتلة مع تعمل غير المتجانسة؛ ولذلك، في بعض الأحيان تأخر التشخيص. ومع تزايد الاهتمام واعتراف أوسع نطاقا في مظاهرة أوائل ATTR، فضلا عن العلاجات الناشئة، اختبار الدراسات التشخيصية الملائمة، بما في ذلك ترانسثيريتين (بعد) الوراثية، للتأكد من الأنواع وبالتالي فمتغيرات أتتر الأساسية لتحسين التشخيص. التحليلات الجينية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) أساليب تأكيد وجود الطفرات نقطة بعد أسرع بكثير وأكثر أمنا من الطرق التقليدية مثل الجنوب وصمة عار. هنا، علينا أن نظهر تأكيد الوراثية للطفرة Ala97Ser أتتر، أن الطفرة المستوطنة الأكثر شيوعاً في تايوان. يتضمن البروتوكول أربع خطوات رئيسية: جمع عينات الدم كله واستخراج الحمض النووي والتحليل الجيني لجميع exons بعد أربعة مع بكر، وتسلسل الحمض النووي.
ترانسثيريتين (بعد) الداء النشواني (أتتر) هو الشكل الأكثر شيوعاً للداء النشواني الجهازية وراثية1، ويمكن أن يكون سببها طفرة موروثة المهيمن جسمية في الجينات ترانسثيريتين (بعد)2. الطفرات بعد زعزعة استقرار هيكل البروتين تيتراميريك ويؤدي إلى الانفصال عن إلى مونومرات أن يعيد إلى ييفات اميلويد2. وكانت الطفرات بعد أميلويدوجينيك أكثر من 1001المبلغ عنها في جميع أنحاء العالم. تأكيد وجود طفرة نقطة بعد التحاليل الجينية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) أساليب والمزايا بما في ذلك تجنب التعامل مع تحقيقات المسمى إشعاعيا بالمقارنة بوصمة عار الجنوبي3. بكر هو تقنية سريعة، سهلة ورخيصة ويمكن الاعتماد عليها الذي تم تطبيقه في العديد من المجالات في العلوم الحديثة4.
التشخيص المبكر لهذا المرض تقدمية وفادح يشكل تحديا نظراً لتغاير المظهرية لها. مع تزايد اهتمام واعتراف أوسع نطاقا في مظاهرة أوائل ATTR، فضلا عن العلاجات الناشئة5، ولذلك الدراسات التشخيصية الملائمة بما في ذلك الاختبار الوراثي بعد الأهمية الأساسية لتحسين التشخيص. وعلاوة على ذلك، ترتبط طفرات مختلفة مع penetrance مختلفة لسمة، وسن، وأنماط التقدم، شدة المرض، ومتوسط البقاء على قيد الحياة، ونجاعة لزرع الكبد، أو بعد مثبتات2،6، و درجات متفاوتة من مشاركة الجهاز العصبي والقلب، التي لها آثار كبيرة على المشورة الوراثية7،،من89. وإلى جانب ذلك، اختبار وراثية دقيقة للغاية هو الأداة الوحيدة التي تميز نوعين متميزين من ATTR: وراثية (المسخ) ونوع البرية (النموذج غير متحولة، خرف الجهازية الداء النشواني، وزارة الصحة)7. من الضروري التأكد من أنواع أتتر، لأن العلاجات تختلف على نطاق واسع2. ولذلك، ثمة ضرورة متزايدة لوصف البروتوكول التدرجي للاختبار الجيني بعد.
سوف يتضح النهج الجزيئية للكشف عن الطفرات استخدام Ala97Ser، أن الطفرة المستوطنة الأكثر شيوعاً في تايوان، على سبيل مثال. تقليل كمية الحلول الثلاثة تستخدم التعديلات في الخطوة استخراج الحمض النووي وينتج كمية كافية من الحمض النووي. في هذا البروتوكول، حللت جميع exons بعد أربعة، بينما المناطق بما في ذلك 5 ‘المنبع، 3’ المصب، والمروجين، إينترونس، والمناطق غير مترجمة (UTR) كانت غير متسلسلة.
هناك اثنين من الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول. أولاً، ينبغي أن تكون عينة هيموديلوتيد من أجل الحصول على عدد كاف من خلايا الدم البيضاء، تجنب11. ثانيا، استخدام المناسبة [بكر] كبسولة تفجير أساسي للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها12. استخدمنا أداة ويب التمهيدي–انفجار …
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر الآنسة وو شين-متعة لمساعدة لها في التجارب. وأيد هذه الدراسة بمنحه من “تشانغ الأمنيون برنامج البحوث الطبية” (CMRPG3C0371، CMRPG3C0372، CMRPG3C0373) والكندي 100-4470A3، 104-2462A3، تايوان.
EDTA-treated tubes | BD | ||
DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
dye | BioLabs | B7021 | |
AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |