El análisis genético de Transthyretin Ala97Ser hereditario relacionadas con amiloidosis
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para confirmar la presencia de la mutación de punto para la diagnosis del amyloidosis de transthyretin hereditario, con Ala97Ser, la mutación más común endémica de Taiwán, por ejemplo.
Abstract
Las pruebas genéticas están la prueba más fiable para hereditaria por transtiretina relacionada con amiloidosis y debe realizarse en la mayoría de los casos del amyloidosis de transthyretin (ATTR). ATR es una enfermedad rara pero fatal con fenotipos heterogéneos; por lo tanto, la diagnosis se retrasa a veces. Con el aumento de atención y el reconocimiento más amplio de manifestaciones tempranas de atributos, así como tratamientos emergentes, estudios diagnóstico apropiados, incluyendo el genética del transthyretin (TTR) de prueba, para confirmar los tipos y variantes del ATR son por lo tanto fundamental para mejorar el pronóstico. Análisis genéticos con métodos de reacción en cadena (PCR) polimerasa confirman la presencia de mutaciones puntuales TTR mucho más rápido y más seguro que los métodos convencionales como la mancha blanca /negra meridional. Aquí, demostramos la confirmación genética de la mutación Ala97Ser ATTR, la mutación más común endémica de Taiwán. El protocolo consta de cuatro pasos principales: recogiendo muestras de sangre entera, la extracción de ADN, el análisis genético de los cuatro exones TTR con PCR y secuenciación de ADN.
Introduction
Amyloidosis de transthyretin (TTR) (ATTR) es la forma más común de amiloidosis sistémica hereditaria1y puede ser causado por una mutación autosómica dominante heredada en la del gene del transthyretin (TTR)2. Mutaciones de TTR desestabilizan la estructura de la proteína tetramérica y conducen a su disociación en monómeros que vuelve a montar en2de las fibrillas amiloideas. Más de 100 mutaciones de TTR amyloidogenic han sido reportados en todo el mundo1. Análisis genéticos con métodos de reacción en cadena (PCR) polimerasa confirman la presencia de la mutación de punto TTR y tienen ventajas como evitar la manipulación de sondas marcadas radiactivamente en comparación con la mancha blanca /negra meridional3. PCR es una técnica rápida, fácil, barata y confiable que se ha aplicado a diversos campos de las ciencias modernas4.
El diagnóstico precoz de esta enfermedad progresiva y fatal es difícil dada su heterogeneidad fenotípica. Con el aumento de atención y el reconocimiento más amplio de las manifestaciones tempranas de atributos así como los emergentes de los tratamientos5, estudios diagnóstico apropiados incluyendo pruebas genéticas TTR son críticamente fundamentales para mejorar el pronóstico. Además, diversas mutaciones se asocian con diferentes penetrancia del rasgo, edad de inicio, patrones de evolución, severidad de la enfermedad, mediana de la supervivencia, eficacia del trasplante del hígado, o TTR estabilizadores2,6, y grados variables de la implicación neurológica y cardiológica, que tienen grandes implicaciones para el asesoramiento genético7,8,9. Además, una prueba genética altamente exacta es la única herramienta que distingue los dos tipos de atributos: hereditario (mutante) y tipo salvaje (no-mutante forma, amyloidosis systemic senil, SSA)7. Es imprescindible confirmar los tipos de atributos, porque los tratamientos varían ampliamente2. Por lo tanto, hay una creciente necesidad para describir el protocolo paso a paso de la prueba genética de TTR.
La aproximación molecular para detectar la mutación será ilustrada con Ala97Ser, la mutación más común endémica de Taiwán, por ejemplo. Modificaciones en el paso de extracción de ADN reducen la cantidad de las tres soluciones que utiliza y produce una cantidad suficiente de ADN. En este protocolo, se analizaron los cuatro exones TTR, mientras incluyendo 5′ contra la corriente, 3′ abajo, promotores, intrones, regiones y regiones sin traducir (UTR) no fueron ordenadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay dos pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, para tener el suficiente número de glóbulos blancos, un espécimen de hemodiluted debe ser evitada11. En segundo lugar, el uso de adecuados primers PCR es fundamental para obtener resultados fiables12. Utilizamos la herramienta de la web de cartilla-BLAST para diseñar los primers4,13; debe cubrir un mínimo de 40 pares de bases en cada lado de los cuatro e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deseamos agradecer a Miss Shin-Fun Wu por su ayuda en los experimentos. Este estudio fue apoyado por una beca del programa de investigación médica Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) y 100-4470A3 de la IRB, 104-2462A3, Taiwán.
Materials
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
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