ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования чтобы сделать условное мутантов из человека малярийного паразита P. falciparum
Summary
Мы описываем метод для генерации glmS-на основе условного нокдаун мутантов в Plasmodium falciparum с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9.
Abstract
Малярия является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. Эта болезнь, которая прежде всего затрагивает людей, живущих в тропических и субтропических районах, вызванного инфекцией с Plasmodium паразитов. Разработка более эффективных лекарственных препаратов для борьбы с малярией может быть ускорен путем улучшения нашего понимания биологии этого комплекса паразита. Генетические манипуляции этих паразитов является ключом к пониманию их биологии; Однако геном P. falciparum исторически трудно манипулировать. Недавно изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 был использован в малярийных паразитов, позволяющие проще белка, пометки, поколение нокдаунов условного белка и удаления генов. Изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 оказался мощным инструментом для продвижения области исследований малярии. Здесь мы описываем ТРИФОСФАТЫ/Cas9 метод для генерации glmS-на основе условного нокдаун мутантов в P. falciparum. Этот метод является весьма адаптированы для других типов генетических манипуляций, включая пометки белка и Джин нокауты.
Introduction
Малярия является разрушительное заболевание, вызванное простейших паразитов рода Plasmodium. P. falciparum, наиболее смертоносной человека малярийного паразита, вызывает около 445 000 смертей в год, главным образом детей в возрасте до пяти1. Plasmodium паразиты имеют сложный жизненный цикл, с участием вектора комаров и позвоночных хост. Сначала люди заражаются когда зараженный комар берет крови еды. Затем паразит вторгается в печень, где он растет, развивается и делит приблизительно одну неделю. После этого процесса паразиты попадают в кровь, где они проходят бесполое репликации в красные кровяные клетки (эритроциты). Рост паразитов внутри эритроцитов непосредственно отвечают за клинические симптомы, связанные с малярией2.
До недавнего времени, производство трансгенных P. falciparum был трудоемкий процесс, с участием нескольких раундов выбора препарата, который занимает много месяцев и имел высокий коэффициент отказа. Это длительная процедура relieson генерации случайных ДНК влезает в регионе интереса и эндогенных способность паразита починить его генома хотя гомологичных ремонт3,4,5,6 . Недавно изменения генома кластерного регулярно Interspaced рецидивирующий Repeat/Cas9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) успешно использовались в P. falciparum7,,8. Введение этой новой технологии в исследований малярии играет решающую роль для углубления понимания биологии этих смертоносных Plasmodium паразитов. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 позволяет для конкретного нацеливания генов через руководство РНК (оформления), которые являются гомологичного гена интереса. Комплекс Cas9 gRNA признает гена через gRNA и Cas9 затем вводит двухручьевой перерыв, заставляя начала ремонт механизмов в организме9,10. Потому что P. falciparum не хватает техники для ремонта разрывы ДНК путем присоединения к не гомологичных конец, он использует механизмы гомологичная рекомбинация и интегрирует transfected гомологичных ДНК шаблоны для ремонта Cas9/gRNA индуцированной двухручьевой перерыв11,12.
Здесь мы представляем протокол для генерации условных нокдаун мутантов в P. falciparum с помощью изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Протокол демонстрирует использование glmS рибозима условно нокдаун белка уровни PfHsp70x (PF3D7_0831700), сопровождающий экспортируемые P. falciparum в принимающей RBCs13,14. GlmS рибозима активируется путем обращения с глюкозамином, (который преобразуется в глюкозамин-6-фосфат в клетках) для расщеплять связанные мРНК, приводит к уменьшению белков14. Этот протокол может быть легко адаптирована для использования других условных нокдаун инструменты, такие как дестабилизации доменов или РНК аптамеры4,5,15. Наши детали протокола поколения ремонта плазмида, состоящий из гемагглютинина (HA) тег и glmS рибозима кодирования последовательности параллельной последовательности, гомологичных PfHsp70x рамка чтения открытая (ORF) и 3′-УТР. Мы также описывают поколения второй плазмида диск выражение gRNA. Эти два плазмиды, вместе с третьим, что диски, проявление Cas9, transfected в эритроциты и используется для изменения генома P. falciparum паразитов. Наконец, мы описываем полимеразной цепной реакции (ПЦР)-на основе технику для проверки интеграции тег и glmS рибозима. Этот протокол является весьма гибкой для модификации или полный нокаут любой P. falciparum генов, повышение нашей способности генерировать новые идеи в биологии малярийного паразита.
Protocol
Representative Results
Discussion
Осуществление ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в P. falciparum как повысить эффективность работы и уменьшилось количество времени, необходимое для изменения генома паразита, по сравнению с предыдущим методами генетической манипуляции. Этот всеобъемлющий протокол описаны шаги, необходимые для генерации…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Muthugapatti Кандасами сердцевиной биомедицинских микроскопии университета Джорджии (UGA) для оказания технической помощи и Хуан Хосе Лопес-Рубио для совместного pUF1-Cas9 и pL6 плазмид. Эта работа была поддержана дуги Фонд награды для D.W.C. и H.M.K., предоставляет средства запуска UGA в.м., гранты от марта Dimes фонда (Basil о ‘ Коннор стартера ученый исследования Award) в.м., и нас национальных институтов здравоохранения (R00AI099156 и R01AI130139) к в.м. и (T32AI060546) для H.M.K.
Materials
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. . World Malaria Report. , (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
