毛细管电泳与亲和毛细管电泳对金属离子 AtHIRD11 固有紊乱与结合的分析
Summary
该协议结合毛细管电泳对蛋白质样品的特性进行了表征, 并对带电配体进行了快速结合筛选。推荐用于具有弹性结构的蛋白质, 如内在紊乱的蛋白质, 以确定不同构象的结合的差异。
Abstract
植物强烈依赖于他们的环境。为了适应压力变化 (例如干旱和高盐度), 高等植物进化出属于内在紊乱的蛋白质 (国内流离失所者), 以减少氧化和渗透胁迫。本文采用毛细管凝胶电泳 (CGE) 和移动性移位亲和电泳 (ACE) 相结合的方式来描述拟南芥不同构象的 AtHIRD11 的结合行为。CGE 用于确认 AtHIRD11 的纯度, 并排除片段、翻译后修饰和其他杂质作为复杂峰值模式的原因。在这一部分的实验中, 不同的样品成分是由一个粘性凝胶在毛细管内的不同质量和检测与二极管阵列探测器。然后, 用 ACE 研究了样品对各种金属离子的结合行为。在这种情况下, 配体被添加到缓冲区解决方案中, 并测量迁移时间的偏移量, 以确定是否发生了绑定事件。使用 CGE 和 ACE 的组合来确定国内流离失所者的结合行为的优点之一是, 有可能自动进行凝胶电泳和结合试验。此外, 专家咨询小组显示的检测限制比经典凝胶电泳和 ACE 能够确定的方式, 结合一个配体的快速方式。此外, ACE 也可以应用于其他带电的物种比金属离子。但是, 使用这种方法进行绑定实验, 其确定绑定站点数量的能力受到限制。然而, 专家咨询小组和 ACE 的结合可以适应于描述任何蛋白质样品对许多带电配体的结合行为。
Introduction
植物比其他许多生命形式更依赖于他们的环境。由于植物不能迁移到其他地方, 它们必须适应周围环境的变化 (例如干旱、寒冷和高盐浓度)。因此, 高等植物开发了像 dehydrins 这样的特殊的应力蛋白, 它完成多种任务, 减少与高盐度有关的细胞应力。这些蛋白结合细胞内的水和离子, 通过结合铜2 +离子来减少氧化应激, 并与磷脂和骨架相互作用。此外, 结合锌2 +离子允许这些蛋白质作为转录因子。在磷酸化后, 它们结合钙2 +离子的能力也被报告了1。
这些蛋白质的多功能行为与无疏水性氨基酸残留有关。因此, 它们缺乏肽链内的任何疏水相互作用, 也没有受约束的结构。然而, 由于这些蛋白质缺乏限制性结构, 它们可以在相同的条件下占据不同的构象。因此, 它们可以被描述为结构的集合, 而不是单一的构造。这些性质的蛋白质被称为内在紊乱的蛋白质 (国内流离失所者), 是一个广泛使用的概念, 在应力蛋白和串扰之间的不同途径真核细胞在真核细胞2。
这些与压力有关的国内流离失所者之一是 AtHIRD11。它是拟南芥最干旱表达的国内流离失所者之一。因此, 不同的构象可以用其有效的半径与电荷比分开, 毛细管电泳 (CE) 已被用于进一步的研究。先前的 ACE 实验证明了 AtHIRD11 和过渡金属离子的相互作用, 如铜2 +-锌2 +-Co2 +和镍2 +离子。详细的结果可以在奥哈拉等地找到。3和 Nachbar等。4。
将在这里使用的 ACE 方法是基于我们以前发布的作品6。然而, 在蛋白质样品中加入 EOF 标记乙酰苯胺是不合适的。AtHIRD11 显示了广泛的峰值模式, 并将 EOF 标记添加到样本将伪装成两个峰值。因此, 标记在单独的运行中使用。在对约束行为进行检验之前, 证实了先前实验中发现的峰值来自不同的构象。因此, CGE 被用来区分蛋白质构象, 转化后的修饰蛋白, 和杂质, 如 AtHIRD11 的片段, 由其不同的质量。然后, 对不同金属离子的特征 AtHIRD11 样品的结合行为进行了研究。
本文的目的是描述一个实验设置, 以区分一个国内流离失所者和其他组成部分的样本, 以评估不同的绑定行为的构象。
Protocol
Representative Results
Discussion
对于所有的 CE 实验, 毛细管的制备是一个关键步骤。由于它是一个小直径的玻璃管, 它可以很容易地打破在涂层被删除时, 它正在处理。将毛细管安装到仪器中应该非常小心。
使用 ACE 方法所涉及的关键步骤主要与实验设置有关。另一个关键步骤是找到正确的样本注入参数。样品的注入量必须足够高的峰值。然而, 重载它将导致一个不太解决的峰值模式与重叠的峰值。在减小注…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Masakuza (日本静冈县大学绿色科技研究院) 提供 AtHIRD11 蛋白质样品。
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
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