Analyse der AtHIRD11 inneren Unordnung und Bindung in Richtung Metallionen durch Kapillare Gelelektrophorese und Affinität Kapillarelektrophorese
Summary
Dieses Protokoll verbindet die Charakterisierung einer Protein-Probe durch Kapillare Gelelektrophorese und ein schnell-Bindung-Screening für geladene Liganden durch Affinität Kapillarelektrophorese. Es empfiehlt sich für Proteine mit einer flexiblen Struktur, wie zum Beispiel intrinsisch ungeordneten Proteine, um irgendwelche Unterschiede für verschiedene Konformere verbindlich festzustellen.
Abstract
Pflanzen sind stark abhängig von ihrer Umgebung. Höhere Pflanzen entwickeln um stressige Veränderungen (z.B., Trockenheit und hohe Salzgehalt) anpassen, Klassen von intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDPs), oxidativen und osmotischen Stress zu reduzieren. In diesem Artikel verwendet eine Kombination von Kapillaren Gelelektrophorese (CGE) und Mobilität Verschiebung Affinität Elektrophorese (ACE) um das Bindungsverhalten von verschiedenen Umformer von IDP AtHIRD11 von Arabidopsis Thalianazu beschreiben. CGE wird verwendet, um die Reinheit des AtHIRD11 bestätigen und Fragmente, posttranslationale Modifikationen und andere Verunreinigungen als Gründe für komplexe Peak Muster auszuschließen. In diesem Teil des Experiments sind die verschiedenen Beispielkomponenten getrennt durch ein zähflüssiges Gel in einer Kapillare durch ihre unterschiedlichen Massen und mit einer Diode Array Detektor erkannt. Danach wird das Bindungsverhalten der Probe gegenüber verschiedenen Metallionen von ACE untersucht. In diesem Fall der Liganden wird hinzugefügt, um die Pufferlösung und die Verschiebung der Migrationszeit wird gemessen, um festzustellen, ob eine verbindliche Ereignis oder nicht aufgetreten ist. Einer der Vorteile der Verwendung von der Kombination von CGE und ACE um zu bestimmen, das Bindungsverhalten des IDP ist die Möglichkeit zur Automatisierung der Gelelektrophorese und Bindung-Assay. Darüber hinaus CGE zeigt eine Untergrenze der Erkennung als die klassische Gelelektrophorese und Ass ist in der Lage, die Art der Bindung eines Liganden in einer schnellen Weise bestimmen. ACE kann darüber hinaus auch auf andere geladene Spezies als Metallionen angewendet werden. Allerdings ist die Verwendung dieser Methode für verbindliche Experimente in seiner Fähigkeit, die Anzahl der Bindungsstellen bestimmen begrenzt. Dennoch kann die Kombination von CGE und ACE angepasst werden, charakterisieren das Bindungsverhalten einer Protein-Probe gegenüber zahlreichen geladenen Liganden.
Introduction
Pflanzen sind stärker abhängig von ihrer Umgebung als viele andere Lebensformen. Da Pflanzen auf andere Orte übertragen können, müssen sie auf Veränderungen in ihrem Umfeld (z.B., Trockenheit, Kälte und hohe Salzkonzentrationen) einzustellen. Daher entwickelt höhere Pflanzen spezialisierten Stress-Proteine wie Dehydrins, die vielfältige Aufgaben zur Zelle Stressabbau im Zusammenhang mit hohem Salzgehalt zu erfüllen. Diese Proteine binden Wasser und Ionen innerhalb der Zellen, reduzieren oxidativen Stress durch verbindliche Cu2 +-Ionen, und die Interaktion mit Phospholipide sowie die Cytoskeletons. Darüber hinaus binden Zn2 +-Ionen können diese Proteine, die als Transkriptionsfaktoren wirken. Ihre Fähigkeit, Ca2 +binden-Ionen nach Phosphorylierung auch wurde berichtet1.
Das multifunktionale Verhalten dieser Proteine bezieht sich auf das Fehlen von hydrophoben Aminosäurereste. Infolgedessen fehlt ihnen jede hydrophoben Wechselwirkungen innerhalb der Peptid-Kette und auch eine eingeschränkte Struktur. Aber weil diese Proteine eine restriktive Struktur fehlt, können sie verschiedene Konformere unter den gleichen Bedingungen belegen. Daher können sie am besten als ein Ensemble von Strukturen und nicht als eine einzelne Konformation beschrieben werden. Proteine mit diesen Eigenschaften werden als intrinsisch Proteine (IDPs ungeordneten) und sind ein weit verbreitetes Konzept für Stress-Proteine und Übersprechen zwischen verschiedene Wege in eukaryotischen Zellen2bezeichnet.
Diese stressbedingte IDPs gehört AtHIRD11. Es ist eine der Arabidopsis Thalianadie meisten sehr Dürre ausgedrückt IDPs. Daher verschiedene Konformere getrennt werden können, durch ihre effektiven Radius, Verhältnis zu berechnen, und Kapillarelektrophorese (CE) für weitere Untersuchungen verwendet worden. Vorherigen ACE Experimente zeigten die Wechselwirkungen zwischen AtHIRD11 und Übergangsmetall-Ionen z. B. Cu2 +– Zn2 +-, Co2 +und Ni2 +-Ionen. Die detaillierten Ergebnisse finden Sie im Hara Et al. 3 und Nachbar Et al. 4.
Die ACE-Methode, die hier verwendet werden, basiert auf unseren früher veröffentlichten Werke6. Die Zugabe von EOF Marker Acetanilid zum Beispiel Protein ist jedoch nicht geeignet. AtHIRD11 zeigt Breite Spitze Muster, und Hinzufügen des EOF-Markers zur Probe zwei Gipfel verschleiern würde. Daher wird die Markierung in einem separaten Lauf verwendet. Bevor das Bindungsverhalten geprüft wird, wird es bestätigt, dass die Gipfel fand während der früheren Experimente aus verschiedenen Umformer sind. So CGE dient zur Unterscheidung zwischen der Protein-Umformer, die Post-translationale modifizierte Protein und Verunreinigungen, wie Fragmente von AtHIRD11, durch ihre unterschiedlichen Massen. Anschließend wird die gekennzeichneten AtHIRD11 Probe Bindungsverhalten gegenüber verschiedenen verschiedenen Metall-Ionen untersucht.
Der Zweck dieses Artikels soll ein Versuchsaufbau IDP und andere Bestandteile einer Probe unterscheiden, um die Unterschiede in der das Bindungsverhalten von verschiedene Konformere bewerten zu beschreiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für alle CE-Experimente ist die Vorbereitung der Kapillare ein entscheidender Schritt. Da es ein Glasrohr mit kleinem Durchmesser ist, kann es leicht an den Stellen brechen, wo die Beschichtung entfernt wird, wenn es behandelt wird. Die Installation der Kapillare in das Instrument sollte sehr sorgfältig durchgeführt werden.
Mit der ACE-Methode vor allem kritische Schritte beziehen sich auf den Versuchsaufbau. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die richtige Probe Spritzparameter finden. Die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Für die Bereitstellung der AtHIRD11 Proteinproben danken wir dankbar Masakuza Hara (Research Institute of Green Science and Technology, Universität von Shizuoka, Japan).
Materials
| AtHIRD11 sample | Shizuoka University (Group Prof. M. Hara) | – | Dehydrin Protein from Arabidopsis thaliana expressed in Escherichia coli |
| Barefused silica capillary | Polymicro Technologies (Phoenix, USA) | 106815-0017 | TSP050375, 50 μm inner diameter, 363 μm outer diameter, polyimide coating |
| Agilent 1600A | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | comercially not available anymore | Capillary electrophoresis instrument; Agilent 7100 CE can be used instead |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G7100A | Capillary electrophoresis instrument |
| Injekt 2 mL | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | Syringe for filtration |
| Rotilabo-syringe filters | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | KY62.1 | PVDF membrane filter for solution filtration |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.023 | Micro pipette for sample handling |
| Eppendorf Research plus 10 μL | Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany) | 3121 000.120 | Micro pipette for handling the ligand solutions |
| Bulb pipette 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 08 | Preparing theNaOH solution |
| Bulb pipette 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 338 14 | Preparing the ligand solution |
| Duran glas volumetric flask 25 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1457 | Preparing the ligand stock solution |
| Duran glas volumetric flask 10 mL | Duran Group GmbH(Mainz, Germany) | 24 671 1054 | Preparing the ligand stock solution |
| Proteome Lab SDS MW Gel Buffer | Beckman Coulter (Brea, USA) | comercially not available anymore | Separation during capillary gel electrophoresis / Alternative SDS buffer: CE-SDS run buffer from Bio-Rad Laboratories (München, Germany) Catalog Number: 1485032 |
| Acetanilide | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 397229-5G | Electroosmotic flow marker |
| Manganese(II) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 13217 | Ligand |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 431788-100G | Rinsing ingredient |
| Bariumchloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 202738-5G | Ligand |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 71729-100G | Solublizing protein for capillary gel electrophoresis |
| Nickel(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 654507-5G | Ligand |
| Selenium(IV) chloride | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 323527-10G | Ligand |
| 2-amino-2-hydroxy-methylpropane-1.3-diol (Tris) | Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) | 252859-100G | Buffer ingredient |
| Zinc(II) chloride | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1088160250 | Ligand |
| Strontium nitrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1078720250 | Ligand |
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1371015000 | Ligand |
| 37% hydrochloric acid | Merck Millipore ( Darmstadt, Germany) | 1003171000 | Adjusting pH |
| Copper(II) chloride dihydrate | Riedel-de Haën (Seelze, Germany) | 31286 | Ligand |
| Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L | Allpax (Papenburg, Germany) | 10000084;0 | Ultrasonic bath |
| Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1 | Agilent Technologies (Waldbronn, Germany) | G2070-91126 | Software packages to operate the CE instruments, acquisite data and evaluate it |
References
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